miR-210与缺血性脑卒中＊

彭拥军，徐疏影，李忠仁，洪 浩，储继红，蔡 云

（1.江苏省中医院 南京中医药大学附属医院 南京 210029；2.南京中医药大学 南京210029）

脑卒中因其高发病率、高致残率、高致死率及高复发率的特点，多年来受到国内外学者普遍关注。据最新流行病学统计，脑卒中占据了全球5%的伤残调整寿命年[2]，且造成了10%人口死亡人数的致死病因[3]。其中，缺血性脑卒中约占总体的70%，且其发病风险率为18.3%，远高于8.2%的出血性脑卒中发病风险率[4]。

miRNA是一种非编码RNA转录本，长度从20到24个核苷酸不等。目前，越来越多的证据显示miRNA具有潜在效用。在各类疾病中，其通过调控单个或多个基因来影响蛋白表达[5]。大多数miRNA表达水平与血氧含量密切相关，低血氧含量可直接导致miRNA表达的变化。同时，绝大多数miRNA可反向影响血氧供应，并可调控脑缺血再灌注后的细胞凋亡过程。而miR-210是缺氧特异性miRNA，其被认为是缺氧相关性miRNA最重要因子之一，其可促进内皮细胞形成血管并通过多种途径参与心血管疾病发生与发展过程。已有研究证明，在脑组织缺血缺氧同时，内皮细胞内的miR-210表达上调[6]。近年来大量实验数据显示，miR-210表达与缺血性脑卒中有密切的相关性，本文就此谈论miR-210在脑缺血发生后的调控机制。

1 调节细胞缺氧应答反应

机体在缺氧条件下，细胞会发生各类应答反应，其目的是缓解组织缺氧并清除不可逆受损细胞[7]。刻下，生物化学数据分析显示，miR-210启动子区域含有一个功能性的低氧反应原件（hypoxia response element，HRE），能被缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）识别，从而在缺氧条件下诱导miR-210转录，所生成miR-210再作用于相对应的靶信使RNA，以调节细胞缺氧应答反应，使细胞适应缺氧内环境[8]。因此，在缺氧状态下，miR-210被认为是调控细胞应答反应的关键因子[9]。

1.1 调控线粒体代谢

过往研究表明miR-210可以减少线粒体活性氧（ROS）过量产生。铁-硫簇支架蛋白（ISCU）的异构体ISCU1与I SCU2是miR-210的直接靶点之一。Ma等[10]通过体内与体外模型，发现介导新生儿HI后氧化性脑损伤的新机制，研究显示抑制miR-210可显著改善新生儿缺氧缺血性脑损伤（HI）以及暴露于缺氧-葡萄糖剥夺（OGD）下的初级皮层神经元线粒体功能障碍、氧化应激和神经元丢失。这些效应是通过ISCU介导的。因此实验证明在脑缺血时，miR-210可抑制线粒体代谢率。

然而Ma等[11]通过流式细胞术、MTT、免疫印迹等方法对内皮祖细胞衍生的外泌体（endothelial progenitor cell-derived EXs,EPC-EXs）在脑缺血再灌注损伤时内皮细胞（EC）的凋亡、活力、ROS产生及血管生成能力（迁移和管形成）进行分析，结果发现EPC-EXs通过改善线粒体功能来保护EC免受H∕R损伤，并且miR-210富集可以增强其作用。

1.2 细胞增殖与细胞周期

1.2.1 细胞增殖

Wang等[12]运用qRT-PCR检测40名急性脑梗死（ACI）患者及对照组血清中miR-210的表达，并以其血清处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC），进行CCK-8测定以检查细胞增殖，结果发现ACI患者血清中miR-210的表达显著增加，且ACI患者血清诱导增殖率增高，HUVEC凋亡率显著降低，可知miR-210可能通过调节内皮细胞的增殖和凋亡参与ACI的发病机制。此外有研究表明，miR-210作用还可通过FGFRL1和HOXA1蛋白质靶点调控细胞增殖，HOXA1的过表达可激活P44∕42MAP激酶，促进细胞增殖[13]。

1.2.2 细胞周期

促凋亡蛋白（BNIP3）属于只含有非典型BH3结构域的Bcl-2蛋白质家族的成员之一，参与调节各项细胞生物学行为，如细胞增殖、凋亡、自噬、分化等，并在肿瘤的发生发展，脑缺血缺氧损伤等过程中起重要作用。而目前已有试验表明在缺氧情况下，miR-210与BNIP3表达密切相关。Luan等[14]在缺氧条件下使用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC-12）细胞，通过qRT-PCR法与Western印迹法分别鉴定miR-210的表达水平，及BNIP3蛋白表达，结果发现缺氧显着诱导PC-12细胞中miR-210的上调，同时证明了BNIP3是PC-12细胞中miR-210的靶基因，miR-210过表达通过下调BNIP3，改善了缺氧诱导的PC-12细胞损伤。杨亮等[15]MCAO大鼠脑梗死体积及脑皮质区miR-210 mRNA、BNIP3mRNA及BNIP3蛋白表达情况，最终发现脑缺血再灌注损伤后miR-210过表达，与BNIP3 mRNA表达趋势相一致，故miR-210与BNIP3协同参与脑缺血再灌注损伤。

E2F3是miR-210的另一直接靶点[16]，E2F3有两个同源异构体，为E2F3a和E2F3b，E2F3a的表达在细胞周期过程中受严格调控，呈波动性，而E2F3b在整个细胞周期中持续、稳定表达，早期实验已证明miR-210能在细胞周期的关键点调节这两类功能上特异的E2F3异构体的相对平衡，从而调控细胞周期[17]。Bian等[18]通过MTT、PCR、Western blotting等方法检测OGD∕R损伤模型中miR-210的表达与E2F3 mRNA和蛋白表达的变化，最终发现miR-210作为上游因子，可抑制OGD∕R诱导细胞凋亡，通过直接抑制其靶基因E2F3的蛋白表达，在心肌细胞中发挥保护作用。

1.2.3 抑制DNA修复

miR-210可通过去乙酰化DNA错配修复基因1启动子，或在DNA错配修复基因2启动子处由HIF-1α∕SP1取代Myc，从而破坏DNA修复[19]。另外，有数据显示miR-210靶向RAD52（DNA损伤修复蛋白52），其协助将RAD51（DNA损伤修复蛋白51）加载到DNA上形成参与同源依赖修复（HDR）的核蛋白丝[20]。有研究证实，在缺氧环境下，miR-210参与使HDR活性显著降低，其可能时抑制RAD52可提供一种额外的机制[21]。

2 调控炎症因子的表达

近年来，多项研究发现，脑组织缺氧缺血时，如急性脑梗死的发生，可引发炎症因子的释放，引起炎症反应发生[22]。王君[23]通过临床医学，动物实验及细胞研究，采用RT-qPCR、ELISA等方法比较miRNA-210 ACI患者及健康人群血清中的表达差异，并评估血清中miRNA-210表达水平在ACI患者的诊断和预后预测中的作用以及与患者血清中炎症因子水平的相关性后发现在急性脑梗死患者中，血清miRNA-210表达水平与血清炎症因子CRP、IL-6、NGAL水平均升高，提示miRNA-210在促进炎症反应方面可能发挥作用。Huang等[24]通过RT-qPCR，流式细胞术和免疫组化等方法评估MCAO模型大鼠脑组织内炎症相关基因的表达和脑中各种免疫细胞的浸润及活化，发现使用miR-210-LNA可显著降低脑梗死并改善MCAO诱发的行为缺陷，且同时改善了大鼠长期行为恢复；抑制miR-210显着降低促炎细胞因子（TNF-α，IL-1β和IL-6）和趋化因子（CCL2和CCL3）的表达。综上，抑制miR-210显示促炎反应及减少缺血性卒中急性期的脑损伤，为miR-210抑制治疗急性缺血性卒中的新治疗策略的分子基础提供新策略。可见，抑制miRNA-210的表达可以降低促炎细胞因子的表达水平，从而减轻脑缺血缺氧后的脑损伤的严重程度。

3 促进新生血管再生

血管新生是一个复杂与高度调控的过程，包括内皮细胞的活化、增殖、迁移、发芽，基底膜形成、新血管生成成熟，是缺血性脑卒中后生理功能恢复的首要因素。缺血缺氧环境下，脏器组织可出现代偿性的血管新生，以改善缺血区的血供情况。zeng等通过对成年雄性C57BL∕L大鼠立体定向注射LV-miR-210，在随后的28天观察中得到内皮细胞数量大大增加，结果表明miR-210是促血管形成关键因素[25]。而目前有诸多研究表明，miR-210可多方面调控血管新生，改善缺血性脑卒中的供血供氧状况。

3.1 诱导VEGF表达

血管内皮生长因子（VEGF）信号通路是介导血管新生的重要通路之一，其调控血管发生发展过程，包括内皮细胞的增殖、迁移、分化、生成等多个方面，同时，VEGF参与血管内皮祖细胞增殖和分化，具有显著的促血管新生作用。miR-210是缺氧特异性微小RNA。已有研究证明，miR-210在缺血缺氧条件下表达上调，通过上调VEGF表达促进血管再生。娄远蕾等[26]通过构建pGCSIL-GFP-pre-miR-210重组质粒表达载体，并转染HUVE-12后，观察GFP阳性表达细胞数、miR-210表达变化与细胞培养上清中VEGF含量，发现miR-210过表达可使内皮细胞VEGF表达上调以促使内皮细胞迁移，最终形成毛细血管管腔样结构，证实在缺血缺氧条件下，miR-210上调VEGF表达，促进血管再生。发现梁国安等[27]采用HE染色、免疫组织化学染色法观察HIBD新生鼠于模型制备后第1、3、7 d脑组织病理变化，并检测VEGF及CD34蛋白表达水平，并计数微血管密度（MVD），以PCR检测脑组织中miR-210表达水平。结果发现与HIBD后第1 d比较，模型组HIBD后第3、7 d miR-210表达、VEGF表达、MVD计数均上升；HIBD后第1、3、7 d模型组miR-210表达、VEGF表达、MVD计数明显高于对照组和假手术组。相关分析显示，HIBD小鼠脑组织miR-210表达与MVD、VEGF呈明显正相关关系。可知，在缺血缺氧时，脑组织后可诱导miR-210上调，促进脑组织VEGF表达，调控血管再生。Meng等[28]检测MCAO大鼠模型缺血病灶周围血管新生及神经前体细胞表达程度，结果发现内皮祖细胞（EPCs）参与新生血管形成，且miR-210在局灶性脑缺血再灌注后显著上调，miR-210促进VEGF-C在体外和体内的表达，荧光素酶报告基因检测显示，miR-210直接靶向SOCS1的30个未翻译区域，miR-210在其中过表达，HEK293细胞或EPCs降低了SOCS1，增加了STAT3（信号传感器和转录激活因子3）和VEGF-C表达式。由此可知，miR-210通过SOCS1-STAT3-VEGF-C通路促进新生血管形成和神经前体细胞迁徙。Zhang等[29]向MCAO大鼠模型的脑缺血损伤区域靶向注射RGD-exo:miR-210后，将CD34进行成像与定量分析，并与RGD-exo:NC大鼠进行比较，最终发现在RGD-exo:miR-210大鼠模型的脑损伤区域内VEGF表达上调，且微血管密度显著增加，可知miR-210在脑缺血病变区域诱导血管生成。

综上，在脑缺血缺氧条件下miR-210表达上调，通过上调VEGF表达促进血管再生。

3.2 下调靶基因ephrinA3

ephrinA3是miR-210的下游靶基因，是促血管新生功能的一个关键直接靶点[30]。赵宁[31]用qPCR与ELISA法分别检测缺血缺氧状况下患者血浆中miR-210的表达水平及ephrinA3浓度，结果发现缺氧状态下，患者血浆中miR-210的表达与靶基因ephrinA3表达呈负相关。不仅在内皮细胞中，miR-210抑制EphrinA3，诱导促血管生成反应；Besnier等也通过实验研究发现缺血缺氧增加了循环促血管生成细胞（PAC）中的miR-210，可显著上调内皮细胞中miR-210的表达水平，通过靶向ephrinA3促进血管生成[32]。

Fasanaro[33]在实验中发现:miR-210过表达可诱导ephrinA3蛋白的下调，却不诱导ephrinA3 mRNA的下调；缺氧诱导ephrinA3蛋白质水平的下调，而ephrinA3 mRNA表达矛盾增加；且实验还发现通过抑制miR-210表达可阻止由缺氧诱导的ephrinA3蛋白下调，可说明缺氧诱导的ephrinA3蛋白下调是通过miR-210的上调来实现的，从而促进血管再生。高法粮[34]通过建立MCAO大鼠模型，前三组分别于缺血后1、3、7 d处死大鼠,留取缺血皮质区脑组织待检。假手术组不做缺血处理，后通过实时PCR检测各个时间点缺血皮质区miR-210的表达水平并与假手术组进行比较，探究脑缺血下miR-210动态表达变化，并采用RT-PCR法及免疫荧光染色法检测各个时间点缺血皮质区ephrinA3的基因表达水平与缺血皮质区ephrinA3阳性细胞数，研究脑缺血后ephrinA3的基因表达变化与ephrinA3的蛋白表达变化，最终证明脑缺血可促进miR-210表达上调，并抑制miR-210的靶基因ephrinA3的蛋白表达，miR-210过表达除可抑制其靶基因ephrinA3的蛋白表达外，还可显著上调VEGFNotch信号通路的分子表达水平。研究结果提示，脑缺血可诱导miR-210的过表达，进一步通过VEGFNotch信号通路参与缺血损伤后血管新生的调控过程。

4 调控神经功能

4.1 促进神经元再生

从出生以后神经发生就被维持，并且在损伤情况下被再次激活[35]。有研究证明，当神经干细胞克服定向分化、炎症与排斥反应等过程时，修复脑缺血诱发的神经损伤则可通过神经干细胞移植来实现[36]。在脑缺血后，miRNA参与脑组织损伤后的神经发生过程。早期，Giraldez等[37]通过研究miRNAs调控斑马鱼大脑形态发生时发现，敲除Dicer酶可导致斑马鱼大脑发育严重缺陷，从而证明了miRNAs在神经元的发生与凋亡中起关键作用。Liu等[38]通过miRNA基因芯片及Qrt-PCR方法分析在制备MCAO模型大鼠后7d脑室下神经前体细胞，观察神经前体细胞中miRNA表达变化，首次发现miR-210表达升高。

Zeng等[39]通过检查循环血液MicroRNA谱，并将其与对照组相比，结果发现24种MicroRNA在卒中患者中表达不同，生物信息学分析显示MicroRNAs调控网络在卒中级联中得分最高，其由10个微小RNA组成，包括关键的缺氧相关miR-210及其下游靶脑源性神经营养因子（BDNF）。由该项研究可知，慢病毒介导的miR-210过表达可增强缺血小鼠脑微血管密度和神经祖细胞数量，并改善脑缺血小鼠的神经行为，同时miR-210上调增加与脑缺血小鼠脑组织内的mBDNF∕proBDNF蛋白表达正相关；双荧光素酶报告基因测定法鉴定出BDNF是miR-210的直接靶标，可证明miR-210可促进脑缺血损伤后的神经再生。Watts等[40]通过一系列研究证实miR-210直接调节靶基因，其参与神经元可塑性，神经退行性等多项神经元活动。Zhang等[41]通过PCR等方法观察神经损伤的大鼠模型中miR-210的表达水平，最终发现miR-210模拟物可促进雪旺氏细胞的增殖和迁移，而miR-210抑制剂则抑制雪旺氏细胞的增殖和迁移，实验进一步发现miR-210对生长相关蛋白-43，髓鞘相关糖蛋白及髓鞘碱性蛋白的表达有影响；综上可知，miR-210对雪旺细胞的增殖和迁移有影响，且参与周围神经再生。

4.2 抑制神经元再生

Ma等[42]通过向Rice-Vannucci模型中的10日龄新生大鼠脑室内注射miR-210模拟物（icv），互补锁核酸寡核苷酸（miR-210-LNA），糖皮质激素受体（GR）激动剂和拮抗剂后，使用荧光素酶报告基因测定，最终发现缺氧显著增加脑中miR-210水平，icv降低GR蛋白丰度并加剧幼鼠的HI脑损伤；且HI损伤后4小时miR-210-LNA增加GR蛋白丰度，降低HI诱导的神经元死亡和脑梗塞面积，并改善神经功能恢复；综上可知，miR-210抑制可降低缺氧诱导的神经元死亡，恢复神经功能。Huang等[24]通过对MCAO模型试验证明，miR-210-5p的过表达降低了MCAO大鼠原代海马神经元中的突触数量，而miR-210-5p的特异性抑制导致更多突触的形成；使用miR-210-LNA对MCAO模型治疗可显着降低脑梗死并改善MCAO诱发产生的行为缺陷，进一步改善了MCAO大鼠行为恢复度。

有学者对于miR-210对神经功能互为矛盾的影响做了进一步研究及报告。Voloboueva等[43]通过研究发现降低miR-210水平来增强线粒体功能，则可以改善炎症条件下新生神经元的存活，而miR-210抑制（miR-210-LNA）保护线粒体酶细胞色素c的活性氧化酶和乌头酸酶。其指出，前体细胞增殖减少可能是由于抑制了miR-210-LNA的AMP调节的蛋白激酶-视网膜母细胞瘤轴。由此可知，线粒体保护是一把双刃剑，早期抑制会减少增殖，但后期的抑制会显着增加神经细胞的存活。

5 应用前景及展望

综上所述，缺血性脑卒中发生后，在脑组织缺血血氧环境下，miR-210的表达量与细胞应答反应、血管新生与神经功能的调控等反应密切相关。然而，缺血性脑卒中的发生发展过程十分复杂，体外或体内试验而得出的研究结果是否适用于人体复杂的内环境也未可知，有待于进一步证明。同时miR-210对其调控机制的研究仍处于早期阶段。因此，进一步深入研究miR-210在缺血性脑卒中后病理生理中的调控机制有重要意义，可为缺血性脑卒中在临床诊疗上奠定夯实的理论基础。