猪圆环病毒2 型(PCV2)LAMP 现场可视化快速检测试剂盒主要原材料的研究

张 琪,张皖静,张晓霞,赵悦琪,吴文静,袁文天,许 燕*,赵 凯

(1 上海师范大学生命科学学院,上海200234;2 上海博满生物科技有限公司,上海201106;3上海市农业科学院生物技术研究所,上海201106)

猪圆环病毒2 型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是单股负链DNA 病毒,直径约17 nm,是现阶段最小的动物病毒[1-3]。 由PCV2 病毒引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)发病迅速,流传广泛,病猪难以治愈且死亡率高,对国内乃至全世界的养猪业危害极大[4]。 PCV2 常常与某些病毒混合感染,如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、弓形体、附红细胞体等,可促进相关疾病的发作。 PMWS 典型症状包括进行性消瘦、呼吸困难、厌食、精神不振、毛发蓬乱,且20%的猪出现黄疸[4-6]。 肉眼检查肠系膜及腹股沟淋巴异常肿大和肺部灰褐色炎症病变最常见,其他一些器官如肝、脾、胰、胃、小肠和结肠也常见肿大及坏死病变[7-8]。 由于PCV2 严重破坏猪的免疫系统,引起免疫力低下,一旦猪体内存在其他病毒或细菌、原虫感染,就会暴发流行。 目前该病已广泛流行于美国、法国、中国、韩国等国家,给世界各国养猪业造成的损失巨大[9-10]。

目前用于PCV2 的检测方法主要由3 种,分别是常规PCR、ELISA 和基因芯片检测[11-13]。 PCR 技术是一种常规的分子生物学检测技术,但易出现假阳性或假阴性结果[11]。 ELISA 检测有局限性,检测过程严格、复杂,需要专业设备和专业人员在专业实验室内进行,灵敏度较低,无法在现场进行检测[12]。 目前普遍看好的基因芯片技术存在难以推广应用的障碍,如基因芯片检测成本高、芯片制作系统昂贵,且需要激光共聚焦扫描仪,限制了芯片技术的应用[13]。 因此,需要开发出一种快速、简便、灵敏和精确的方法检测PCV2 病毒。

环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)针对靶基因的6 个区域设计4 条特异引物,利用链置换Bst DNA 聚合酶,在恒温65 ℃左右,约60 min,即可扩增出LAMP 特征性梯状条带[14-16]。 LAMP 检测技术具有以下优点:特异性比PCR 强;灵敏度比PCR 高10 倍;速度快,需40 min 即可;成本低,易推广;产物检测便捷,可以进行现场可视化快速检测[17-19]。 该技术对仪器没有特殊要求,只需金属浴便可完成整个反应过程,而且操作简单,易于基层推广[20-21]。 本实验室已研发了猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP 现场可视化快速检测试剂盒,本试验拟进一步对该试剂盒的原材料进行研究,以实现试剂盒检测性能的最优化,为PCV2 LAMP 现场可视化定性检测技术的药证申报奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源

阳性参考品:猪圆环病毒2 型(PCV2)病毒;阴性参考品:猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV);均由上海市农业科学院畜牧兽医研究所惠赠。

1.2 主要试剂

配套试剂(25 mmol∕L dNTP、 LAMP 反应缓冲液、Bst 酶)分别购自南京诺唯赞生物科技有限公司(诺维赞)、上海闪晶生物有限公司(闪晶)和北京蓝谱生物科技有限公司(蓝谱)。

病毒基因组DNA∕RNA 提取试剂盒和质粒提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司; CFI 染料为上海博满生物科技有限公司产品。

1.3 PCV2 靶基因序列的选择

首先从NCBI 数据库找出一系列PCV2 毒株的基因序列,再通过DNAMAN 比对找到PCV2 的保守区,将保守区的序列进行BLAST,选择可能符合要求的特异性序列。 在NCBI 数据库中以ORF2 基因为关键词检索已公布PCV2 的BJ0804 株全序列,选择ORF2 基因(GenBank:EU921257)的保守区作为靶序列,全长233 bp。

1.4 引物设计

根据PCV2 ORF2 靶基因,通过Primer Explorer V5 软件分析,设计选择3 对引物(表1),LAMP 扩增之后观察扩增条带的亮度和清晰度情况,并最终选择了1 对最佳引物。

表1 PCV2 LAMP 反应扩增引物Table 1 LAMP detection primers of PCV2

1.5 PCV2 LAMP 检测试剂盒的组装和使用

PCV2 LAMP 检测试剂盒主要包括A 液和B 液,为了防止污染,试验过程在不同区域进行。

(1)在实验室一中将A 液(FIP∕BIP 或F3∕B3 或LF∕LB,25 mmol dNTP,CFI 染料,Bst 酶)混合风干于PCR 管盖;然后将B 液(ddH2O,10 ×buffer,100 mmol Mg2+)加入PCR 管内,封盖(盖紧),做成半成品,封装。

(2)将实验室一配置好的体系带入实验室二,B 液加入相应的阳性模板,换上在实验室一配置的带有吹干试剂A 液的管盖。 倒置2 min,上下颠倒5 次,以充分将PCR 管里的试剂与管盖上吹干的试剂混匀。

(3)将加好模板的PCR 管放入金属浴61 ℃、40 min 进行扩增,反应结束,可直接观察颜色变化;也可将扩增产物放在荧光显色仪(苏州优科生物技术有限公司)下观察荧光。

在基于LAMP 技术的猪PCV2 现场可视化定性快速检测方法上,选择LAMP 反应的最优条件进行试验。

1.6 试剂盒标准阳性对照的制备

用设计好的引物PCV2-F3∕B3 进行PCV2 病毒DNA 的PCR 扩增,扩增产物的回收与纯化按照天根生化科技(北京)有限公司试剂盒的说明书操作。 将纯化的产物与载体pMD18-T vector 连接,转入到感受态细胞中培养,对阳性克隆进行鉴定,测序后使用天根生化科技(北京)有限公司质粒快速抽提试剂盒提取质粒,并测其含量,按照病毒学方法计算对应的拷贝数,-20 ℃保存备用。

用PCV2 LAMP 检测试剂盒检测40 例猪血清样品,将阳性血清和阴性血清分开保存,将阳性血清的显色结果与PCV2 病毒质粒的显色结果进行比对,选择与阳性血清显色结果同样清晰明亮的质粒浓度作为阳性对照模板。 首先将抽提的质粒进行一系列的浓度梯度稀释,然后对每个浓度梯度的质粒模板进行LAMP 扩增,与40 例猪血清中的阳性血清显色结果进行比对,挑取显色结果较好的质粒含量作为阳性对照。

1.7 空白对照制备

空白对照为无RNA 酶的水,用移液器量取1 mL 的DEPC,补纯化水至1 000 mL 混匀,然后在灭菌锅中121 ℃、20 min 高温高压灭菌,室温保存。

1.8 Bst 酶和LAMP 反应缓冲液的比对研究

将3 家公司的Bst 酶、dNTP 和LAMP 反应缓冲液按LAMP 反应体系的用量进行配制,分别加入含量为1 ×104拷贝∕μL 的PCV2 DNA,进行LAMP 检测,重复3 次。 根据电泳结果和显色指示进行分析,评价3 家公司的Bst 酶、dNTP 和LAMP 反应缓冲液对LAMP 反应的影响。

1.9 Bst 酶和LAMP 反应缓冲液质量鉴定研究

选择试验结果较好的公司的Bst 酶,用于LAMP 扩增反应体系。 按照本企业《原材料检验作业指导书》,以阳性对照为模板,进行LAMP 扩增,观察LAMP 扩增结果,重复3 次。

1.10 试剂盒阴性参考品和阳性参考品的制备与试验

阳性参考品:取200 μL PCV2 病毒培养液的母液提取DNA。 按梯度稀释,梯度为10-1(1010个病毒∕μL)至10-13(1 个病毒∕μL),稀释后分别进行LAMP 检测,重复3 次。

阴性参考品:取200 μL PRV、SFV 和PRR 病毒培养液的母液提取DNA,分别进行LAMP 检测,重复3 次。

2 结果与分析

2.1 试剂盒标准阳性对照的制备

从40 例猪血清样品中鉴别出24 例阳性血清,将24 例阳性血清的PCV2 LAMP 显色结果与含量不同的质粒(梯度稀释)的PCV2 LAMP 显色结果进行比对,发现质粒含量为1 ×104拷贝∕μL 的显色结果与阳性血清的显色结果较接近,所以选择含量为1 ×104拷贝∕μL 的质粒作为阳性对照。

2.2 Bst 酶和LAMP 反应缓冲液的比对

根据LAMP 扩增产物的电泳结果和显色指示(图1),LAMP 扩增产物电泳梯状条带清晰度和亮度越高越好,扩增产物的颜色变化越明显越好。 在诺维赞、闪晶、蓝谱3 家公司样本中,第5—6 组(诺维赞)LAMP 扩增产物电泳梯状条带清晰度最好,条带亮度最高,且在染料CFI 作用下颜色变化最明显。 综合比较,诺维赞的Bst 酶和LAMP 反应缓冲液扩增效果较好,因此选择该公司的试剂。

2.3 Bst 酶和LAMP 反应缓冲液质量鉴定

将诺维赞所生产的Bst 酶和LAMP 反应缓冲液用于LAMP 扩增反应体系,进行多次重复验证。 如图2所示,其阳性对照显色结果为蓝色,阴性对照为紫色;在荧光显色仪下,阳性呈绿色,阴性呈橙色,表明Bst酶在LAMP 扩增中重复性好、稳定性高。

2.4 试剂盒阳性参考品研究

如图3 所示,LAMP 检测中,阳性参考品10-1(1010个病毒∕μL)—10-11(5 个病毒∕μL)和阳性对照的颜色为蓝色,荧光显色仪下为绿色;阳性参考品10-12(2 个病毒∕μL)—10-13(1 个病毒∕μL)和阴性对照的颜色没有变化,为紫色,荧光显色仪下为橙色,说明阳性参考品稀释度为10-11(5 个病毒∕μL)可进行反应,灵敏度较高。

2.5 试剂盒阴性参考品研究

如图4 所示,LAMP 扩增反应中阴性参考品和阴性对照均无扩增,肉眼观察为紫色,荧光显色仪下为橙色;阳性对照肉眼观察为蓝色,荧光显色仪下为绿色,说明阴性参考品特异性好,选择合适。

3 结论与讨论

PCV2 病毒传播方式多样,不仅在环境中大量存在,而且在动物体内也是广泛分布,各种组织包括血液、精液均可以检测出PCV2,再加上PCV2 主要侵害猪的淋巴细胞,破坏免疫系统,导致PCV2 防控难度增加[22]。 目前,用来检测PCV2 病毒的技术有很多,本试验采用的LAMP 技术是一种新型的基因扩增技术,近年来在动物疫病快速诊断中起着重要作用[23-24]。

本研究按照如下条件来选择用于LAMP 检测PCV2 的靶基因:PCV2 特异性的靶基因,其他生物没有该同源序列的基因,或者存在可检测区分的基因突变位点。 首先下载一系列不同毒株的靶基因序列进行比对分析,找出靶基因的保守区;同时用BLAST 对设计的引物序列进行了同源性分析,以保证引物可以特异扩增。 在Bst 酶和LAMP 反应缓冲液的比对研究中,对比了3 家不同公司的试剂,发现诺维赞的试剂效果较好;在Bst 酶和LAMP 反应缓冲液质量鉴定研究中,选择的Bst 酶在LAMP 反应过程中能够有效地工作,稳定性高、重复性好;在阳性参考品研究结果中,阳性参考品的颜色变化明显,荧光显色中,阳性参考品和阴性对照显色区别明显,阳性参考品的灵敏度较高,选择合适;在试剂盒阴性参考品研究结果中,3 种病毒参考品都未出现颜色变化,荧光显色中,阴性参考品与阳性对照显色差别明显,说明阴性参考品的特异性好,选择合适。

本研究建立了基于LAMP 的猪PCV2 现场可视化定性检测方法。 在此检测方法的基础上,优化之后的LAMP 检测法能对PCV2 进行可视化、现场快速检测,同时该检测方法具有特异性强、灵敏度高、省时快速、操作简单、经济实用、仪器简单且无需专业人员进行操作的特点。 与许宗丽等[25]建立的LAMP 检测方法相比,本研究在引物中增加了环形引物,LAMP 反应时间减半;因为LAMP 检测法对生物样品的耐受性优于其他检测方法,猪血清可直接作为模板,省去DNA 提取步骤。 此外,在配置体系过程中,将试剂A 混匀吹干在PCR 管的管盖上,最大程度地保护了试剂的活性,保存时间长,室温可存放7 个月,可常温运输,避免了冷链运输;试剂B 封装于PCR 管中,只需加样一次,在反应之前加入染料,DNA 扩增后,无需开盖,可直接显色可视化判断结果,减少了污染风险;试验结果可通过双显色系统进行鉴别;设备简单,只需一台金属浴。 本研究建立的检测方法可用于养殖场和基层检测机构的临床检测。

本试验对LAMP 检测技术进行了主要原材料的研究,后期将继续进行相关研究,如试剂盒参考值研究、分析性能评估、技术要求、稳定性、工艺及反应体系研究分析等,并申报药证。 本研究可为其他相关LAMP 试剂盒的药证申报提供参考。