矾根叶柄和叶片不定芽高效再生体系优化

孙 翊,殷丽青,张永春*,庹晓庆,付正龙,田 莉,3

(1 上海市农业科学院林木果树研究所,上海201403;2 上海安康园艺工程有限公司,上海201111;3长江大学园艺园林学院,荆州434025)

矾根(Heucheraspp.)是虎耳草科矾根属(Heuchera)植物的统称,原产于美洲中部,为宿根花卉类群。其花叶兼美,叶色亮丽且颜色丰富,是不可多得的新优彩叶地被观赏植物,可作为边饰、丛植、地被、盆栽等材料应用[1],也可用于土壤修复[2],在我国花卉市场上关注度不断上升。 目前,大部分矾根品种以无性繁殖方式进行种苗生产[3]。 分株繁殖和扦插繁殖周期长、繁殖系数低、受季节影响大[4]。 组织培养技术是现今规模化繁育矾根种苗的主要方法。 矾根的组培快繁技术绝大部分以芽作为起始扩繁的材料[5-8],存在取材困难、数量较少、对母株破坏性大等问题。 已有的研究显示,矾根叶柄和叶片经诱导均可获得愈伤组织,然而两者的诱导率不高,分别为19%和11%[9]。 利用矾根叶柄作为起始扩繁材料建立矾根离体再生体系,不定芽分化率较高,达81.25%[10],然而该方法需经过愈伤组织阶段,且期间需要更换培养基,操作较为复杂。

植物高效再生体系的建立是成功进行基因转化的基础,能够为深入开展植物遗传机理研究和品质改良提供重要支撑[11]。 本研究以矾根无菌苗的叶柄和叶片作为外植体,通过对培养条件和植物生长调节剂浓度进行筛选,直接诱导并分化获得不定芽,旨在建立一种更为简便、经济且有效的矾根直接再生体系,为矾根种苗的快速繁殖及新品种的培育奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以矾根‘巴黎’和‘闪秋’无菌苗的叶柄和叶片为外植体,将叶柄剪成0.8—1 cm 长,叶片剪成约0.5 cm×0.5 cm,用于后续接种。

1.2 试验方法

将外植体接种于培养基上进行诱导,每皿接种12 个外植体。 培养基成分:以MS 为基本培养基,均添加3%蔗糖、0.6%琼脂粉、0.1 mg∕L 萘乙酸(Naphthylacetic acid,NAA),并分别添加不同浓度的噻重氮苯基脲(Thidiazuron,TDZ)和6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA)。 所有培养基pH 均为5.8,并经121 ℃、0.11 MPa 的高温、高压灭菌20 min。 培养室温度为(24 ±2) ℃,先进行暗培养,再转移至光照强度为(35 ±3)μmol∕(m2·s),光照12 h∕黑暗12 h 条件下培养。

1.2.1 暗培养时间的筛选

将外植体接种于MS+0.2 mg∕L TDZ+0.1 mg∕L NAA 培养基上进行培养,暗培养时间设置0 d、7 d、14 d、21 d 和28 d 共5 个处理,之后进行光照培养,每个处理重复4 次,接种50 d 后统计不定芽再生率和不定芽数。 不定芽再生率=分化获得有效不定芽的外植体数∕接种的外植体数×100%;不定芽数为每皿12 个外植体总计分化获得的有效不定芽数量。

1.2.2 植物生长调节剂种类和浓度的筛选

以MS +0.1 mg∕L NAA 为基础,分别添加不同质量浓度的TDZ(0.1 mg∕L、0.2 mg∕L、0.5 mg∕L、1.0 mg∕L)或者6-BA(0.2 mg∕L、0.5 mg∕L、1.0 mg∕L、2.0 mg∕L)配制培养基,将外植体接种于其上进行培养,暗培养时间为21 d,之后进行光照培养,每个处理重复4 次,30 d 后统计不定芽再生率和不定芽数。

1.3 数据统计

分析采用SPSS 17.0 软件进行方差分析(ANOVA)和多重比较分析(Duncan),显著水平P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 不同暗培养时间对矾根叶柄和叶片不定芽再生的影响

在不同的暗培养时间条件下,矾根‘巴黎’和‘闪秋’的叶片和叶柄均能够产生不定芽,不定芽再生率和不定芽数在处理间具有明显差异(表1 和表2)。 随着暗培养时间的增加,矾根不定芽再生率和不定芽数均呈现出先升高再下降的趋势,均在暗培养21 d 时达到峰值。 而品种间具有一定的差异性,‘巴黎’的再生情况优于‘闪秋’,表现为前者的不定芽再生率和不定芽数总体高于后者。 此外,在不同外植体材料间,‘巴黎’叶柄的再生情况优于叶片,而‘闪秋’叶片的再生情况优于叶柄。 ‘巴黎’的不定芽再生率最高为56.25%,‘闪秋’为45.83%;‘巴黎’的不定芽数最高为9.75 个,‘闪秋’为7.75 个。

表1 不同暗培养时间对矾根叶片不定芽再生的影响Table 1 Effects of different periods of darkness culture on the adventitious shoot regeneration from leaf blades of Heuchera spp.

表2 不同暗培养时间对矾根叶柄不定芽再生的影响Table 2 Effects of different periods of darkness culture on the adventitious shoot regeneration from petioles of H. spp.

2.2 植物生长调节剂种类和浓度对矾根叶柄和叶片不定芽再生的影响

以矾根‘巴黎’和‘闪秋’叶片和叶柄作为外植体,在各自适宜培养基的条件下(叶片为MS+0.5 mg∕L 6-BA+0.1 mg∕L NAA,叶柄为MS+0.2 mg∕L 6-BA+0.1 mg∕L NAA),光照培养10 d 左右(即培养30 d 左右),外植体伤口附近均能够出现浅绿色的凸起,表明外植体已经开始进行不定芽的分化;经过50 d 左右的培养,分化获得的不定芽形态十分明显(图1、图2)。

由表3 可知,随着植物生长调节剂浓度的增加,矾根叶片不定芽再生率和不定芽数均呈现先上升后下降的趋势,低浓度处理效果优于高浓度。 而6-BA 的处理效果要优于TDZ,前者处理的‘巴黎’平均不定芽再生率为59.38%,‘闪秋’为67.71%,远高于后者的22.92%和28.13%。 两个品种的叶片再生不定芽情况均在0.5 mg∕L 6-BA 的培养基上表现最佳,矾根的不定芽再生率达到最高,‘巴黎’为62.50%,‘闪秋’为75.00%。 与此同时,不定芽数也最多,分别为20.50 个和21.25 个。 综上,MS +0.5 mg∕L 6-BA +0.1 mg∕L NAA 是矾根叶片产生不定芽的最适培养基。

表3 不同浓度TDZ 与6-BA 对矾根叶片不定芽再生的影响Table 3 Effects of different concentrations of TDZ and 6-BA on the adventitious shoot regeneration from leaf blades of H. spp.

由表4 可知,随着TDZ 及6-BA 浓度的增加,矾根叶柄不定芽再生率和不定芽数均呈现下降趋势。 且6-BA 的处理效果要优于TDZ,前者处理的‘巴黎’平均不定芽再生率为81.25%,‘闪秋’为59.90%,远高于后者处理的34.38%和14.06%。 在0.2 mg∕L 6-BA 的培养基上,矾根‘巴黎’和‘闪秋’的叶柄再生不定芽情况表现最佳,分别为89.58%和77.08%,不定芽数也最多,分别为28.50 个和12.50 个。 ‘巴黎’的再生情况略优于‘闪秋’。 综上,MS +0.2 mg∕L 6-BA +0.1 mg∕L NAA 是矾根叶柄产生不定芽的最适培养基。

表4 不同浓度TDZ 与6-BA 对矾根叶柄不定芽再生的影响Table 4 Effects of TDZ and 6-BA concentrations on the adventitious shoot regeneration from petioles of H. spp.

3 讨论

不同基因型矾根属植物愈伤组织诱导效果不同。 红花矾根(H.sanguinea)叶柄在MS +4.40 μmol∕L 6-BA +0.19 μmol∕L NAA 培养基上的愈伤组织诱导率最高可达90%[12];而矾根(H.micrantha)叶柄在MS+6-BA 0.5 mg∕L 的培养基上愈伤组织诱导率仅为19%[9]。 田莉等[10]以矾根‘巴黎’叶柄作为起始扩繁材料,经过60 d 左右的诱导及分化培养,获得的不定芽分化率为81.25%,相对较低,且操作复杂,污染几率大。 本文建立的方法适用于两种不同的矾根品种,其外植体在同一种培养基上经过50 d 左右的培养可获得不定芽,是今后进行矾根属植物不定芽再生研究的首选方法之一。

光照对植物器官的形成具有诱导作用,外植体在暗培养下进行脱分化,在光照培养下进行再分化,最终可形成愈伤组织和不定芽[13-14]。 在蝴蝶兰、枣树等的研究中发现,适当长度的暗培养有利于不定芽的再生[15-16]。 本研究结果表明,暗培养时间过短或过长均不利于矾根不定芽再生,21 d 是矾根不定芽再生的最佳暗培养时间。

植物生长调节剂的种类、浓度与配比是调节外植体形成愈伤组织或不定芽的重要影响因素[17-18]。 田莉等[10]研究显示,低浓度的NAA 更适宜矾根‘巴黎’愈伤组织的诱导,且在MS +0.5 mg∕L 6-BA +0.5 mg∕L NAA 培养基上仅产生愈伤组织,无法分化获得不定芽[10]。 邹清成等[19]利用矾根叶片作为外植体,在MS+2.0 mg∕L 6-BA +0.1 mg∕L NAA 培养基上诱导获得愈伤并进一步形成不定芽,分化率为68.67%,相对较低。 矾根‘巴黎’和‘闪秋’在MS+2.0 mg∕L 6-BA+0.1 mg∕L NAA 培养基上,诱导率不高的同时还会出现一定程度的玻璃化现象,会对后续获得种苗的质量产生不利影响。 本研究结果表明,多种植物生长调节剂的复合使用,能够达到在同一种培养基上完成脱分化和再分化过程的效果,使矾根获得较高的不定芽再生率。 培养基中添加的NAA 能够与细胞分裂素相互作用促进矾根愈伤组织的诱导;添加TDZ 或6-BA 能够有效促进矾根不定芽的分化。 但是,若植物生长调节剂浓度过低,则不能够有效促进外植体再生,浓度过高,则易产生玻璃化问题[1]。 本研究建立的矾根不定芽再生方法,利用含有较低浓度植物生长调节剂的培养基,结合光照条件的变化(21 d 暗培养和30 d 光照培养),叶柄和叶片两种外植体上均再生出优质的矾根不定芽。 该方法在获得较高不定芽再生率的同时解决了不定芽的玻璃化问题,并可减少变异产生,不定芽再生效果良好。

综上,本研究以叶柄和叶片作为外植体,通过开展不同暗培养时间以及不同植物生长调节剂种类和浓度对矾根不定芽再生影响的研究,建立了一种取材范围更广且更为简便、经济且有效的矾根不定芽再生方法。 该方法可以克服以芽作为起始扩繁材料的局限,进一步扩大了外植体取材范围;提高矾根的不定芽再生率(矾根‘巴黎’高达89.58%);在同一种培养基上经诱导和分化直接再生获得不定芽,有效简化操作并节约生产成本。 同时,优化了矾根不定芽高效再生体系,能够为种苗的快速繁殖、新品种培育以及利用基因工程手段进行性状的改良提供良好的技术支持。 本研究显示,矾根叶柄比叶片更容易诱导产生不定芽,但在相同外植体个数下获得的不定芽数量在不同品种间具有差异。 针对特定矾根品种,可对其叶柄和叶片诱导产生的不定芽数量进行比较,从而确定该品种不定芽再生的最佳外植体材料。