猪ZFAND6 基因克隆、序列分析及其多态位点检测

吴华莉,涂尾龙,曹建国,王洪洋,张莺莺,谈永松

(上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海种猪工程技术研究中心,上海201106)

人ZFAND6 基因又称AWP1(蛋白激酶C 相关激酶1 相关蛋白)基因。 有研究证实,AWP1 编码208个氨基酸,在人的组织中广泛表达,与肿瘤发生及细胞凋亡有关[1]。 鼠ZFAND6∕AWP1 具有ZnF-A20 和ZnF-AN1 两种锌指结构域,A20 是一类Cys∕Cys2 类型锌指结构,在转录因子NF-κB 信号通路中发挥重要作用[2]。 有研究证实具有锌指结构的民猪ZFAND5 基因cDNA 已被克隆出来,并且第4 外显子存在突变位点,但关于其功能研究未见报道[3]。 目前,在美国国家生物技术信息中心(NCBI,网址https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕gene∕? term=ZFAND6)已有人、鼠、牛、狗和鸡等ZFAND6 基因的电子克隆序列,但有关ZFAND6 基因如何参与动物机体的功能研究以及猪ZFAND6 基因序列克隆、编码蛋白质功能未见报道。脐疝是猪生长发育中最常见的疾病之一,其发病率一般在0.13%—5%。 脐疝是指腹腔内容物(主要脱出腹腔脏器为小肠与网膜)由脐部薄弱缺损部位突出于腹外[4]。 患脐疝的猪不仅生长缓慢,脱出脐孔的脏器还会引起感染,从而损害猪的使用性能,影响猪的销售。 引起猪脐疝发生的原因复杂,有的是先天性的遗传缺陷,如猪出生前脐孔发育不全或者腹壁闭合不完全;有的是后天环境造成的,如断脐不当,引起脐孔损伤。 遗传因素在其发病机制中具有重要作用[5-6]。 丁能水等[7]用覆盖猪基因组范围内的194 个微卫星标记对白色杜洛克×二花脸F2脐病资源家系进行基因型扫描和全基因组关联分析,在1 号、2 号、7 号和10 号染色体共同检测到与猪脐病相关联的微卫星标记,7 号染色体上的SWR1928 标记区域显示与脐疝的显著易感相关性。 吴丽花等[8]对F2∕F3脐病核心资源群体SWR1928 附近的39 个SNPs 进行基因分型,采用传递不平衡检验(Transmission disequilibrium test,TDT)分析方法进行检测,结果表明:ZFAND6、EFTUDI和TGFβ3 基因的共7 个多态位点与脐疝呈显著相关。 本试验以‘申农猪’为研究材料,拟扩增猪ZFAND6 编码区序列,并对ZFAND6 基因在‘杜洛克猪’‘长白猪’‘大白猪’‘梅山猪’和‘申农猪’群体中的SNP 位点进行筛选,以期为揭示猪ZFAND6 基因的遗传特性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取来自上海富民农场的‘申农猪’,屠宰后迅速取其肝脏组织,放置于RNA 组织保存液中带回实验室,-70 ℃保存备用,采集肝脏组织用于提取RNA,克隆猪ZFAND6 基因编码区序列。 用于基因SNP 位点筛选的群体包括‘杜洛克猪’(100 头)、‘大白猪’(150 头)和‘长白猪’(80 头),共计330 头,来自上海祥欣畜禽有限公司。 ‘梅山猪’(110 头)来自于上海状元猪场;‘申农猪’(70 头)来自上海富民农场。 采集猪耳组织块用于提取总DNA,检测猪ZFAND6 基因g.2395C ＞T 位点和g.15060A ＞G 位点的多态性。采集后耳组织块放置于预先加入75%酒精的1.5 mL Eppendorf 管中,保存在冰盒中,运回实验室,放置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 试剂及耗材

组织RNA 提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒、PCR 管、冻存管和琼脂糖等试剂耗材均购于上海生工生物工程股份有限公司;TaKaRa 反转录试剂盒、pMD18-T 克隆载体试剂盒和琼脂糖凝胶电泳检测所用2000 bp Ladder DNA marker 购于大连宝生物工程有限公司;2 ×Taq PCR Master Mix 购于北京康为生物技术公司;限制性内切酶HaeⅢ和MboⅠ购于美国Fermentas 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 猪肝脏组织总RNA 提取及RT-PCR 反应

选取上海富民农场‘申农猪’的肝脏组织,采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 提取组织中的总RNA,去除基因组中残留的DNA,采用紫外分光光度计与1.5%琼脂糖凝胶电泳两种方法检测总RNA 的浓度和质量。 按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行总RNA 反转录试验,合成的cDNA 放置于-70 ℃保存备用。

1.3.2 引物设计

根据GenBank(https:∕∕www. ncbi. nlm. nih. gov∕)网站公布的猪ZFAND6 基因电子克隆序列,利用Primer 3.0 在线软件设计2 对引物,分别为ZFAND6-1F、ZFAND6-1R 和ZFAND6-2F、ZFAND6-2R,用于基因编码区扩增;用于SNP 位点检测的2 对引物分别为ZFAND6-3F、ZFAND6-3R 和ZFAND6-4F、ZFAND6-4R[9](表1)。 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 用于检测ZFAND6 基因编码区的引物和SNP 检测引物Table 1 Primers for detecting coding region of ZFAND6 gene and SNP detection primers

1.3.3 PCR 扩增体系及反应条件

采用PCR 管配置反应体系(20 μL):2 ×Taq PCR Master Mix 11 μL,cDNA 模板0.8 μL,上下游引物各0.4 μL,RNase-Free ddH2O 7.4 μL。 PCR 反应条件:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35 个循环;72 ℃终延伸10 min,4 ℃冰箱保存。 PCR 产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果,采用凝胶成像系统拍照保存电泳图片。

1.3.4 PCR 扩增目的片段TA 克隆与鉴定

采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR 扩增的目的片段,加入pMD20-T 克隆载体,置于16 ℃恒温水浴锅,反应时间为30 min,进行连接后转化,将转化的菌液均匀涂布在琼脂平板培养基上,37 ℃培养过夜,第二天形成单菌落。 挑取菌落,进行菌落PCR 鉴定,获得与预期目的条带大小一致的菌液,送上海生工生物工程股份有限公司测序,根据测序结果进行生物信息学分析。

1.3.5 生物信息学分析

使用NCBI 的ORF Finder 程序分析猪ZFAND6 基因开放阅读框(ORF); ProtParam(http:∕∕web.expasy.org∕protparam∕)、Lasergene7.1 软件包中的Editseq 软件和Protean 软件分析猪ZFAND6 蛋白的一级结构和理化性质;PredictProtein(http:∕∕www. predictprotein. org)分析蛋白质的二级结构;SWISS-MODEL(http:∕∕swissmodel.expasy.org∕)和PyMol 软件分析蛋白质的三级结构; PSORTII Prediction(http:∕∕psort.hgc.jp∕form.html)预测蛋白质的亚细胞定位; Protfun(http:∕∕www.cbs.dtu.dk∕services∕ProtFun∕)在线软件对猪ZFAND6 蛋白的功能进行预测分析;SMART(http:∕∕smart.embl-heidelberg.de∕)在线软件分析蛋白质结构域; Lasergene 7.1 软件包中的MegAlign 软件进行同源性分析及系统进化树构建。

1.3.6 PCR-RFLP 分析

PCR 扩增产物经琼脂糖电泳检测,目的条带单一明亮,进行酶切反应,酶切体系(16 μL):PCR 产物4 μL,10 ×Buffer 2 μL,HaeⅢ(MboI)0.5 μL,ddH2O 9.5 μL,反应时间为15 min 左右。

等位基因频率和基因型频率计算依据群体遗传学计算公式。 A 基因频率=(2AA+Aa)∕2(AA+Aa +aa) ×100%;a 基因频率=(2aa+Aa)∕2(AA+Aa +aa) ×100%;基因型频率=基因型个体数∕总个体数×100%。 A 和a 表示等位基因。 等位基因指位于一对同源染色体的相同位置上控制着相对性状的一对基因。 本试验中g.2395C ＞T 位点等位基因为C 和T,g.15060A ＞G 位点等位基因为A 和G。 若成对的等位基因中两个成员完全相同,则为纯合子;若两个等位基因各不相同,则为杂合子。 g.2395C ＞T 位点纯合子为CC 和TT,杂合子为CT;g.15060A ＞G 位点纯合子为AA 和GG,杂合子为AG。

2 结果与分析

2.1 猪肝脏组织提取总RNA 检测

采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测猪肝脏组织总RNA的完整性(图1),并测得其A260∕A280 比值在1.8—2.0,表明RNA 完整性较好,未发生降解,且无蛋白和DNA 污染;测得其质量浓度为86 ng∕μL,符合RT-PCR 反应的要求。

2.2 猪ZFAND6 基因PCR 扩增CDS 区检测和RFLR-PCR 结果检测

猪ZFAND6 基因RT-PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,分别获得629 bp 和991 bp 两条明亮的条带,与预期大小一致(图2)。 将目的条带进行切胶回收,连接pMD20-T 克隆载体,将克隆后的阳性菌液送公司测序,最终获得猪ZFAND6 基因CDS 区序列。

ZFAND6-3F、FAND6-3R 引物扩增内含子g.2395C ＞T 存在HaeⅢ酶切位点,分为TT(462 bp)、CT(462 bp、324 bp、138 bp)和CC(324 bp、138 bp)3 种基因型。ZFAND6-4F、ZFAND6-4R 引物扩增3’UTR区域g.15060A ＞G 存在MboⅠ酶切位点,分为AA(244 bp、218 bp)、AG(244 bp、218 bp、144 bp、100 bp)和GG(218 bp、144 bp、100 bp)3 种基因型(图3)。

2.3 猪ZFAND6 基因CDS 区核苷酸序列及编码氨基酸序列分析

登录NCBI(https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕)网站,寻找到DNA 的Open Reading Frame Finder 程序分析(https:∕∕www.ncbi.nlm.nih. gov∕orffinder∕)网址,提交猪ZFAND6 基因序列,并参照Kozak 法则进行分析,结果显示:ORF 的长度为624 bp,起始密码子AGA 位于163 bp 处,终止密码子TGA 位于729 bp 处,表明猪ZFAND6 基因CDS 区全长624 bp。 软件分析其碱基组成分别为A 含量31.45%、T 含量29.44%、G 含量20.05%、C 含量19.05%,共编码208 个氨基酸(图4)。 (A+T)含量为61%,高于(G+C)39%的含量。

2.4 猪ZFAND6 蛋白的理化性质分析

蛋白质的理化性质包括分子量、氨基酸组成比例、理论等电点及蛋白质的疏水性等[10]。 用ProtParam与Protean 软件预测猪ZFAND6 蛋白的理化性质,结果显示:猪ZFAND6 蛋白由208 个氨基酸残基组成,分子式C950H1530N280O327S15,分子量22 587.1 u,理论等电点(pI)为6.87,说明该蛋白为酸性蛋白质。 氨基酸残基中Ser(15.38%)、Val(8.17%)和Gln(7.21%)的频率较高,不稳定系数为54.08,属于不稳定类蛋白质,预计在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30 h。 疏水指数为58.51,平均亲水性为-0.680,属于可溶性蛋白。

2.5 猪ZFAND6 蛋白三级结构预测

组成蛋白质的氨基酸通过肽键相互连接构成的一级结构在空间发生折叠时,就形成蛋白质的二级结构[11]。 使用PredictProtein 软件预测猪ZFAND6 蛋白的二级结构,结果表明:猪ZFAND6 蛋白二级结构主要由α-螺旋、β 折叠和无规卷曲3 种常见类型构成。 采用SWISS-MODEL 和PyMol 软件对猪ZFAND6 蛋白建模获得三级结构模型(图5),表明猪ZFAND6 蛋白的三级结构与二级结构预测结果基本一致。

2.6 猪ZFAND6 亚细胞定位和蛋白结构域预测

猪ZFAND6 蛋白的亚细胞定位预测分析结果显示:猪ZFAND6 蛋白在细胞质分布较多,占65%,在线粒体和溶菌体分布较少,均为10%,在内质网系统分布比例为15%,但在粗面内质网和光面内质网的比例不确定。 利用NCBI蛋白结构保守域分析软件发现,猪ZFAND6 蛋白具有ZnFA20 结构域和ZnF-AN1 结构域(图6)。 蛋白质结构域预测表明:ZnF-A20 结构域位于氨基酸11—35 位置区域,ZnF-AN1 结构域位于氨基酸149—186 位置区域。

2.7 猪ZFAND6 蛋白同源性及系统发育分析

利用MegAlign 软件对猪、原鸡、家鼠、人等物种的ZFAND6 蛋白氨基酸序列进行同源性比较并构建系统进化树(图7),结果表明:猪ZFAND6 蛋白氨基酸序列与牛、羊在系统进化树中距离最近;ZFAND6 蛋白进化树与生物进化的物种树基本一致,符合物种进化规律,说明ZFAND6 基因编码区在物种间比较保守。

2.8 g.2395C ＞T 位点在5 个猪群体的基因型和基因频率统计

ZFAND6-3F、ZFAND6-3R 引物扩增内含子g.2395C ＞T 的HaeⅢ酶切位点在5 个猪群体的检测结果显示:除了‘长白猪’群体未检出TT 型和‘梅山猪’群体未检测出CC 型外,其他4 个猪群体均检出3 种基因型。 ‘杜洛克猪’和‘梅山猪’群体中CT 型比例较高。 ‘长白猪’‘大白猪’和‘申农猪’群体中CC 型比例较高,基因型频率分别为0.97、0.76 和0.72。

表2 g.2395C ＞T 位点在5 个猪群体中的基因型和基因频率统计Table 2 Genotype and gene frequency of g.2395C ＞T locus in 5 pig populations

2.9 g.15060A ＞G 位点在5 个猪群体的基因型和基因频率统计

引物扩增3’UTR 区域g.15060A ＞G 的MboI 酶切位点在5 个猪群体的检测结果显示:除了‘长白猪’群体未检出GG 型外,其他4 个猪群体均检出3 种基因型。 ‘杜洛克猪’和‘梅山猪’群体中AG 型比例较高。 ‘长白猪’‘大白猪’和‘申农猪’群体中AA 型比例较高,基因型频率分别为0.99、0.84 和0.80。

表3 g.15060A ＞G 位点基因在5 个猪群体中的基因型和基因频率统计Table 3 Genotype and gene frequency of g.15060A ＞G locus in 5 pig populations

3 讨论

本试验首次采用RT-PCR、基因克隆以及核酸测序技术获得了猪ZFAND6 基因CDS 区核苷酸序列,并采用生物信息学方法对猪ZFAND6 基因编码的蛋白理化性质和结构域进行预测分析。 由于大多数蛋白在折叠成天然结构时才具有生物活性,因而对猪ZFAND6 基因编码蛋白的结构预测可为研究其生物功能提供依据。 结构域预测显示,猪ZFAND6 蛋白具有ZnF-A20 和ZnF-AN1 结构域。 有研究证实在原核生物和真菌中,N’端的ZnF-A20 结构域和C’端ZnF-AN1 结构域两者可单独存在或者都存在,但在动物体中2个结构域多数同时存在[12]。 A20 结构域需要结合Zn2+才能形成稳定的结构。 有关研究资料报道证实,A20 结构域可调节白介素细胞1(IL-1)诱导NF-κB 激活,从而产生对促炎症因子TNFα 的免疫应答[2,13]。A20 结构域的基因突变与炎症反应、自身免疫应答和恶性病有关[14]。 AN1 结构域包含有6 个保守半胱氨酸和组氨酸,可以潜在结合Zn2+[15]。

蛋白质同源性的高低在一定程度上反映不同物种间亲缘关系的远近。 猪ZFAND6 蛋白与普通牛、羊、家犬、猴、黑猩猩及人等的氨基酸同源性在95%—97%,表明猪ZFAND6 蛋白与这些物种有较近的亲缘关系,并且ZFAND6 基因编码区在不同的物种长期生物进化过程中具有较强的保守性,未发生较大的变异。 人AWP1 可以激活核因子NF-κB,该因子在生物体内的作用是组织损伤、应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递功能[14]。 根据ZFAND6 基因编码区在不同物种间保守的特性,推测猪ZFAND6 蛋白有可能也参与机体免疫应答反应。

目前有关猪脐病发病的分子遗传机理研究进展有限,仅定位到一些易感区域,并未鉴别到可供育种选择的分子标记或易感基因。 本试验检测猪ZFAND6 基因g.2395C ＞T 位点的T 等位基因频率在‘长白猪’‘大白猪’和‘申农猪’群体中频率较低,而在‘杜洛克猪’和‘梅山猪’群体中频率分别为0.61 和0.68,说明猪ZFAND6 基因g.2395C ＞T 在位点不同猪群体中遗传特性不同。 吕显山[5]对资源家系患脐疝病猪检测结果显示,g.15060A ＞G 位点GG 型为不利基因型。 本试验在‘长白猪’群体内未检出g.15060A ＞G位点不利基因型GG 型,并且GG 型在‘杜洛克猪’‘大白猪’‘申农猪’和‘梅山猪’群体中的比例较低。 这一结果暗示5 个猪群体中GG 不利基因型有被逐渐淘汰的趋势。ZFAND6 基因的g.2395C ＞T 位点和g.15060A ＞G 位点检测结果都表明该基因多态位点在5 个猪群体中表现出不同的遗传特点。 接下来的研究可根据ZFAND6 基因型在不同猪种群的基因型频率变化,利用这些遗传标记结合患脐疝猪个体和健康猪进行疾病的相关性分析,从而为规模化、现代化的养猪场降低脐病发病率提供理论依据。 此外,脐疝多见于小公猪,发生的原因与近亲繁殖有关[16],猪场应避免近亲交配。 有学者研究遗传性大鼠脐疝模型时发现,随着近交系数的增大,大鼠脐疝率升高[17]。 因此,有脐疝或脐疝家族史的公母猪不得留种,早期淘汰相关的有害基因,这可在一定程度上降低猪群脐疝的发生率。