高效液相色谱法快速测定外用成人用品中16种局麻成分

黄艳婷，庄 玥，邱蕴绮

(广东省药品检验所，国家药品监督管理局药品快速检验技术重点实验室，广东 广州 510663)

随着人们生活水平的提高和思想的开放，市面上出现成人用品的种类也日益繁多。口服壮阳产品中非法添加现象经过多年的稽查打假虽已得到抑制，但部分外用成人用品(润滑油、延时喷剂)等却得不到有效监管。一些不法商家利用消费者追求延长房事时间的心理，向外用产品中添加局麻药成分以牟取暴利[1]，但长期大量使用有可能引起各种不良反应，甚至可能引起癫痫、心律失常等严重后果，严重危及消费者或其伴侣健康。局麻药全称为局部麻醉药，是一类通过阻滞钠离子通道，可逆性地抑制神经冲动从而达到神经阻滞作用的药物，其根据中间链的不同，又可分为以普鲁卡因为代表的酯类局麻药，以利多卡因为代表的酰胺类局麻药，以及来源于桃金娘科植物丁香的有效活性成分丁香酚及其衍生物丁香酚类共3类局麻药。其中，酯类和酰胺类局麻成分的检测方法有液相色谱法[2-7]、液相色谱-质谱法[8-9]、紫外分光光度法、毛细管电泳法等，丁香酚类有液相色谱法[10]、液相色谱-质谱法[11-12]、气相色谱法[13]、气相色谱-质谱法[14]等，但这些方法大都局限于检测一类局麻药，未见同时检测3类局麻药的分析方法。

随着液相色谱柱技术的不断发展，利用核壳色谱柱在普通液相色谱上能达到提高分离效率和分离速度的效果[15-16]，具有成本低、短时间内可同时测定多个不同类别成分含量等特点，更适合于基层快检室和移动实验室等在现场检测样品。基于此，本文采用核壳色谱柱建立了外用成人用品中16种局麻药的高效液相色谱快速检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

岛津LC 20-AT高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器)。甲醇为色谱纯;磷酸、磷酸氢二钾和庚烷磺酸钠均为分析纯。16种局麻药标准品：普鲁卡因(Procaine，CAS：59-46-1)、丁卡因(Tetracaine，CAS：94-24-6)购自Aladdin公司;异丁香酚甲醚(Methyl isoeugenol，CAS：93-16-3)购自天津希恩思生化科技有限公司;盐酸氯普鲁卡因(Chloroprocaine hydrochloride，CAS：3858-89-7)、盐酸利多卡因(Lidocaine hydrochloride，CAS：73-78-9)、苯佐卡因(Benzocaine，CAS：94-09-7)、甲磺酸罗哌卡因(Ropivacaine mesylate，CAS：854056-07-8)购于中检院;硫酸丁丙卡因(Butacaine sulphate，CAS：149-15-5)为Toronto Research Chemicals产品;普鲁卡因胺(Procainamide，CAS：51-06-9)、丙胺卡因(Prilocaine，CAS：721-50-6)、丁吡卡因(Bupivacaine，CAS：2180-92-9)、盐酸奥布卡因(Benoxinate hydrochloride，CAS：5987-82-6)、丁香酚(Eugenol，CAS：97-53-0)、盐酸普莫卡因(Pramoxine hydrochloride，CAS：637-58-1)、地布卡因(Cinchocaine，CAS：85-79-0)为上海源叶生物有限公司产品；丁香酚甲醚(Methyl eugenol,CAS:93-15-2)购自Mackin公司;标准品含量均大于93.4%。

1.2 标准溶液配制

精密称取16种局麻药成分标准品各10 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用稀释液(含0.1%盐酸的甲醇溶液)配成质量浓度为1 000 mg/L的贮备液。定性鉴别时将各贮备液用稀释液稀释至25 mg/L;定量分析时将阳性成分贮备液用稀释液稀释成100、50、25、10、5 μg/mL的系列混合标准溶液。

1.3 样品前处理

精密称取1 g(精确至0.001 g)样品，置于10 mL具塞比色管中，加入稀释液(含0.1%盐酸的甲醇溶液)适量，超声处理15 min，冷却至室温，再用稀释液稀释至刻度，摇匀，必要时离心。取上清液过0.45 μm滤膜，待测。若样品中待测成分的浓度超出线性范围，再用稀释液适当稀释处理。

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(50 mm×4.6 mm×2.7 μm);流动相：A为磷酸氢二钾溶液(称取2.28 g磷酸氢二钾和0.41 g庚烷磺酸钠，用水稀释至1 000 mL，用磷酸调至pH 3.0);B为甲醇-乙腈(体积比1∶1);梯度洗脱程序：0～8 min，95%～14%A;8～10 min，14%A;流速：1.5 mL/min;柱温：35 ℃;进样量：10 μL;检测波长为210 nm(利多卡因、丙胺卡因、罗哌卡因、丁吡卡因和普莫卡因)和280 nm(其余成分)。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

实验考察了Agilent Poroshell 120 EC-C18(50 mm×4.6 mm×2.7 μm)、Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm×4.6 mm×2.7 μm)、Acchrom Alphasil VC-C18(100 mm ×3.0 mm×2.5 μm)和Acchrom Alphasil VC-C18(100 mm×4.6 mm×2.5 μm) 4种亚3微米色谱柱对16种局麻药的分离情况。结果显示：16种局麻药在上述4种不同类型色谱柱的保留能力不同，通过优化调节流速和梯度比例等色谱条件后，Poroshell 50 mm色谱柱中各成分能达到基线分离，Acchrom色谱柱中普鲁卡因胺和丁卡因峰出现拖尾现象，其余色谱柱分析时间较长且丁吡卡因与盐酸奥布卡因不能达到基线分离。因此，选择Poroshell C18色谱柱(50 mm×4.6 mm×2.7 μm)进行后续实验。

由于16种局麻药的DAD光谱不尽相同，其中利多卡因等5种成分在200 nm以上无特征吸收波峰，均在210 nm处紫外吸收较强，但210 nm处色谱基线波动较大。其余11种成分均在280 nm处有较强吸收，色谱峰面积更适合定量分析，且280 nm处色谱基线相对平稳。综合光谱及基线波动选择210 nm(利多卡因、丙胺卡因、罗哌卡因、丁吡卡因和普莫卡因)和280 nm(其余成分)作为检测波长。优化条件下的16种局麻药色谱图见图1。

2.2 流动相及稀释液的选择

由于16种局麻药结构差异较大，以磷酸氢二钾为流动相时，丁吡卡因与盐酸奥布卡因等色谱峰分离度较差，普鲁卡因胺保留时间短而受基质干扰，且普鲁卡因类成分可能存在离子化分叉现象。因此，考虑向流动相中添加一定量庚烷磺酸钠以增加保留，并用磷酸调节pH值(2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)。结果发现，在pH 3.0时各成分保留和分离效果最好。另外，实验还考察了甲醇、乙腈、水及其酸化溶液为稀释液配制标准溶液的影响，发现以甲醇(含0.1%盐酸)为稀释液时能显著抑制离子化现象，此时普鲁卡因胺和氯普鲁卡因峰形最好，所有成分的峰面积良好，适合定量分析，因此选择含1%盐酸的甲醇为稀释液。

2.3 样品提取

由于外用成人用品主要为润滑液(油)、男用喷剂、男用湿巾等，样品基质较为简单，实验通过考察甲醇、乙腈、水及其酸化溶液等[17]提取试剂，以及超声、离心等操作，发现加入0.1%盐酸的甲醇溶液后经过简单超声即可完全提取目标成分，同时满足本方法在设备简单的现场操作需求。

2.4 线性方程、检出限及定量下限

取16种局麻药的系列(质量浓度为100、50、25、10、5 μg/mL)混合标准溶液，在优化条件下测定，以各化合物的质量浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标，进行线性回归并绘制标准曲线，外标法定量。以3倍信噪比(S/N=3)计算方法检出限(LOD)，以S/N=10计算定量下限(LOQ)。结果显示，16种局麻药在一定质量浓度范围内线性良好，相关系数(r)均不低于0.999 7;其中，甲磺酸罗哌卡因响应较小，LOD为3.1 μg/g，LOQ为10.2 μg/g;其余15种局麻药的LOD均为1.0 μg/g，LOQ均为3.3 μg/g(表1)。

表1 16种成分的线性范围、相关系数、回收率、检出限及定量下限Table 1 Linear range,correlation equation(r),recovery,detetion limit and quantitation limit of 16 compounds

2.5 回收率、精密度与稳定性

取一个阴性样品(延时喷剂)，分别向其中添加50、100、500 μg/g 3个浓度水平的16种局麻药，在优化条件下处理并测定，每个浓度水平平行实验6次，计算各化合物的平均回收率和相对标准偏差(RSD)。结果表明，16种局麻药的平均回收率为93.3%～103%，RSD(n=6)为0.08%～ 1.2%，满足非法添加化学成分检测的技术要求。

另取一份500 μg/g回收溶液重复进样6次，结果16种局麻药峰面积的RSD均不大于1.2%，保留时间的RSD均不大于0.40%(相差不大于0.05 min)，表明方法重复性良好。将上述溶液室温下放置2、4、8、12、24 h后进样测定，计算得各成分峰面积的RSD均不大于1.4%，保留时间的RSD均不大于0.40%(相差不大于0.06 min)，表明各成分在24 h内稳定。

图2 代表性样品谱图(210 nm)Fig.2 Chromatogram(210 nm) of representative sample

2.6 实际样品测定

从某网上商城收集44批样品，在优化条件下测定，结果显示：久本时光宝盒男士喷剂、印度神油加强版男用喷剂、LDILD 男士喷剂和强狮男用抑菌喷剂检出丁卡因(含量为0.2～14.9 mg/g);微爱男士抑菌喷剂和印度神油(女士试用装)检出丁香酚(含量分别为18.4 mg/g和1.9 mg/g);杜伊特358倍液(第三代)、Ivirgo男士外用喷剂和HOT喷剂检出利多卡因(按盐酸利多卡因计含量为2.5～14.5 mg/g);印度神油(男士试用装)检出利多卡因和丁香酚，按盐酸利多卡因计含量为1.7 mg/g，丁香酚含量为7.1 mg/g。阳性样品10批，检出率22.7%。当检出阳性样品时，可采用加标回收验证，或采用液相色谱-质谱等方法确证。

3 结 论

本研究以稽查关注较少的外用成人用品为研究对象，建立了同时测定16种非法添加局麻成分的液相色谱快速检测方法。结果显示，16种局麻药成分在一定质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数均不低于0.999 7，甲磺酸罗哌卡因的检出限为3.1 μg/g，定量下限为10.2 μg/g，其余化合物的LOD均为1.0 μg/g，LOQ为3.3 μg/g；用其检测市售44批外用成人用品，阳性检出率达22.7%，均为延时喷剂和润滑液，且大部分标识为纯天然、纯中药产品，存在严重的安全隐患。本方法操作简单、准确性高、分析时间短，可为此类产品现场监督提供技术支持，具有广阔的应用前景。