外泌体在胰腺癌诊断中的研究进展*

张艺璇 吕 瑛

南京大学医学院附属鼓楼医院消化内科(210008)

胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，预后通常不佳，位列世界癌症相关死亡的第三位，5年生存率低于9%[1]。手术切除是患者获得长期生存的最佳选择，但由于特殊的解剖位置和疾病早期的非特异性症状以及缺乏有效的早期诊断方法，仅小部分患者(<15%)在诊断胰腺癌时还有手术切除的机会，但这部分患者的5年总体生存率低于30%[2]。因此，早期诊断是改善胰腺癌预后的关键。有研究指出，从胰腺发生突变发展到转移性胰腺癌的时间需近21年[3]，这为早期诊断胰腺癌提供了广阔的时间窗。因此，寻找高敏感性和特异性且可检测无症状恶性或早期胰腺癌的生物学标志物对延长胰腺癌患者的生存期具有重要意义。

外泌体是由几乎所有哺乳动物细胞类型包括肥大细胞、树突细胞、B细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经元等分泌的内吞起源的纳米级(30～150 nm)细胞外囊泡，胞质内含有脂质、蛋白质、DNA、微小RNA(microRNA, miRNA)、mRNA、长链非编码RNA(long noncoding RNA, LncRNA)等，广泛存在于血液、尿液、唾液等多种体液中。癌症患者的外泌体总量显著高于健康人[4]。此外，肿瘤来源的外泌体携带大量亲代细胞的信息，提供了获取肿瘤分子信息的微创途径，代表了肿瘤细胞的集合参数，且可重复采样进行纵向监测，可作为有效的替代生物学标志物来确定肿瘤的类型和分期[5]。

一、外泌体作为胰腺癌诊断标志物的概述

1.外泌体概述：Johnstone发现了一种由网织红细胞释放并分泌到细胞外基质中的囊泡，将其命名为外泌体[6]。外泌体是具有脂质双层膜结构的纳米级囊泡，通过携带非编码RNA、蛋白质等介导局部与全身的细胞间相互作用[7]。

2.外泌体作为胰腺癌诊断标志物的优势：①外泌体脂质双层膜对内含的核酸和蛋白质具有保护作用，使其免受核酸酶和蛋白酶的降解，是可靠的循环生物学标志物[5]；②外泌体减低了流体的复杂性，提高了低丰度分子检出的敏感性[8]；③非侵入性收集外泌体中包含的多种核酸和蛋白质进行多参数测量，从而对特定疾病状态进行分类，可实时监测病情进展和治疗效果以及判断预后[9]。

3.外泌体的分离和提取：外泌体诊断早期胰腺癌需要高回收率、高纯度、省时、低成本、高敏感性、高特异性的外泌体分离检测技术。

①传统的高通量方法：超速离心和密度梯度离心是使用最广泛的外泌体一级分离方法[10]。其中金标准超速离心法操作简单，获得的外泌体数量相对较多，但耗时长，物理剪切力会损伤外泌体，转子类型不同可能会导致回收率不稳定，且纯度也受到质疑[11]。

②新方法：Gao等[12]将TiO2与外泌体脂质双层上的磷酸基团具有高度亲和性并发生特异性结合，可应用于外泌体的分离，下游表征和蛋白质组学分析表明，该法可在5 min内将外泌体从人血清中可逆性分离，且回收率高达93.4%。Lewis等[13]利用交流电动力学微阵列芯片在15～20 min内直接从未经任何预处理或添加稀释样品的全血、血浆或血清中分离出外泌体，并在30 min内对胰腺癌患者目标生物学标志物进行特异性鉴定和定量，将传统的样品制备、外泌体分离与鉴定等复杂过程集成到简单有效的分析模型中。微流控技术是一种新兴的外泌体分离技术，具有样本需求量小、大规模集成、检测速度快、可进行高通量分析等优势，非常适合作为床边诊断的工具[14]。但由于低通量和纳米流体易堵塞，限制了微流控技术的大规模应用。有研究[15]开发了一种多通道纳米流体系统分析原始临床样品，可从健康和患病的临床队列中分离出外泌体，并分析外泌体内的RNA成分，应用机器学习算法生成预测性面板，成功地在盲法研究中区分出胰腺癌患者与健康受试者。

③胰腺癌外泌体的分离：提高外泌体诊断胰腺癌效能的两大主要挑战分别是如何将外泌体从特定细胞中分离出来以及如何在单个囊泡水平上表征外泌体亚群[16]。Lennon等[17]通过纳米粒子跟踪分析、蛋白质组学、转录组学、透射电子显微镜以及定量单分子定位显微镜(qSMLM)，从培养的细胞株对不同来源的外泌体进行初步评估。使用基于敏感荧光成像的qSMLM可量化各外泌体的大小和生物学标志物含量。qSMLM检测血浆样本可成功鉴别出富含胰腺癌外泌体的人群，开发了一种用于单个囊泡的单分子表征策略。

二、外泌体在早期诊断胰腺癌中的应用

胰腺癌生物学标志物CA19-9诊断晚期和有症状胰腺癌的敏感性和特异性分别为80%和82%，但在未发生转移的小病变中，诊断敏感性和特异性迅速下降[18]。此外，5%～10%的人群并不能产生CA19-9[19]。因此亟待探索一种有效、廉价、非侵入性的胰腺癌特异性生物学标志物。

肿瘤细胞释放外泌体至外周血循环，为基因组、蛋白质组等组学技术获取循环外泌体所携带的与亲代细胞有关的核酸和蛋白质等特异性生物学信息提供了可能，可从分子水平实现胰腺癌的早期诊断。

1.外泌体蛋白质：外泌体蛋白质可分为两大类：①外泌体中普遍存在的蛋白，如四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、肿瘤易感基因101(TSG101)蛋白、热休克蛋白(HSP)70、HSP90等，是目前公认的外泌体特异性标志物[20]。②因亲代细胞来源而异的蛋白，可作为胰腺癌特异性外泌体生物学标志物[21]。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1)由蛋白质连接三个硫酸乙酰肝素组成，在胰腺癌等癌症细胞中异常表达，介导癌细胞的生长、转移和血管生成[22]。Melo等[23]的研究行质谱分析发现，肿瘤来源的外泌体富含GPC1，以流式细胞仪分离GPC1阳性的外泌体后，可鉴别健康受试者与胰腺癌患者；进一步多元回归分析证实GPC1阳性外泌体可单独作为生物学标志物预测疾病特异性生存期。说明外泌体GPC1可作为胰腺癌的诊断标志物。Buscail等[24]的前瞻性研究发现，胰腺癌患者的外泌体GPC1显著高于无癌症史和胰腺癌前病变对照组，联合门静脉血和外周血结果的诊断准确性可达78%。但有研究指出，Melo等的研究纳入的胰腺癌患者多处于晚期，仅包括少数癌前病变，故研究结论可能存在偏倚[25]。Lucien等[26]的研究结果显示血浆GPC1外泌体水平并不能区分胰腺癌和胰腺良性疾病患者。Lai等[27]发现血浆外泌体GPC1水平无法区分胰腺癌与非肿瘤性对照组，且肿瘤切除后外泌体GPC1水平仅略降低，而胰腺癌患者外泌体miRNA水平明显升高，并在胰腺切除后恢复正常。表明miRNA诊断胰腺癌的效能优于GPC1。上述研究结果存在差异的原因可能是首先GPC1并不是一种组织特异性蛋白质，癌组织表达的GPC1可能与其他组织的正常分泌物混杂在一起。其次，许多实验采用血清样本检测GPC1，血清中含有大量活性凝血因子，并不能确定其是否会裂解GPC1，导致错误的结果[22]。此外，不同的样本量或应用不同的GPC1抗体亦可能会导致结果发生差异[28]。因此，GPC1是否可作为胰腺癌的诊断标志物仍需后续研究进一步证实。

2.外泌体核酸：与蛋白质生物学标志物相比，检测RNA具有更高的敏感性和特异性，且分析成本更低。与DNA相比，RNA生物学标志物可更好地动态观察细胞的调控和状态，且circRNA和miRNA的稳定性较高。Srinivasan等[29]采用Illumina TruSeq法对外泌体小RNA进行多次重复性测序，证实了高通量测序分析外泌体中小RNA作为生物学标志物来区分正常和疾病个体的可行性。

①MiRNA：MiRNA通过结合靶mRNA 3’-UTR，诱导mRNA降解或翻译抑制[30]，导致靶基因的转录后沉默，调节靶基因表达，参与肿瘤增殖、凋亡和转移过程。胰腺癌细胞与正常胰腺导管上皮细胞中miRNA表达谱不同，表明外泌体miRNA可作为可靠的胰腺癌生物学标志物。Que等[31]通过RT-PCR技术检测49例患者血清miRNA，结果显示胰腺癌细胞来源的外泌体中高表达miR-17-5p和miR-21，可用于鉴别胰腺癌和胰腺良性肿瘤。Nakamura等[32]通过超速离心法分离胰腺癌和慢性胰腺炎患者的胰液，结果显示胰腺癌患者外泌体miR-21和mi-R155表达显著高于慢性胰腺炎患者(P均<0.05)，结合胰液细胞学可将诊断准确性升至91%。然而，miR-21在其他恶性肿瘤(包括胃癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和肝癌)中亦高表达，故其鉴别胰腺癌与其他肿瘤的临床价值极具争议[9]。Lai等[27]发现胰腺癌血浆外泌体miR-10b、miR-21、miR-30c和miR-181a高表达，而外泌体miR-let7a低表达，能区分胰腺癌与对照组，且胰腺癌患者切除胰腺24 h内外泌体中高表达的四种miRNA降至正常水平，表明血浆外泌体miRNA是诊断胰腺癌的潜在生物学标志物。

②CircRNA：CircRNA的主要作用之一是结合功能性miRNA调控基因的表达，circRNA在物种间的高丰度、相对稳定性、半衰期长和进化的保守性使其成为许多疾病尤其是癌症的潜在生物学标志物[33]。Li等[34]证实circRNA IARS在外泌体中富集并稳定存在，在胰腺癌组织和转移性肿瘤血浆外泌体中的表达上调，并可增加血管内皮细胞通透性，促进肿瘤侵袭和转移，表明外泌体circRNA有望成为胰腺癌早期诊断和预后监测的循环生物学标志物。有研究[35]通过微阵列分析从肝转移性胰腺癌细胞外泌体中鉴别出circRNA PDE8A，可通过促进上皮-间质转化介导胰腺癌细胞的侵袭性生长，其高表达与胰腺癌患者的病情进展和预后相关，有望成为胰腺癌的生物学标志物。

3.外泌体多参数分析：综合分析多个外泌体的生物学标志物可提高敏感性和特异性，有助于胰腺癌的早期诊断。Madhavan等[36]通过流式细胞仪检测出血清胰腺癌起始细胞外泌体蛋白质标志物(CD44v6、Tspan8、EpCAM、MET和CD104)，采用qRT-PCR方法鉴定出4种较非胰腺恶性肿瘤对照组表达明显上调的miRNA(miR-1246、miR-4644、miR-3976和miR-4306)，两者联合诊断胰腺癌的敏感性和特异性分别为100%和80%。Xiao等[37]联合外泌体GPC1、CD82和CA19-9诊断胰腺癌的ROC曲线下面积达0.942，可有效区分健康人与胰腺癌患者以及胰腺炎与胰腺癌患者。目前外泌体单变量分析极大地限制了诊断的敏感性和特异性，需充分利用外泌体包含肿瘤细胞集合参数的优势，进行外泌体多参数分析，以提高诊断的准确性。

三、小结与展望

胰腺癌是一种复杂的侵袭性疾病，由于缺乏有效的早期诊断方法而预后极差。理想的胰腺癌诊断方法应可明确局部良恶性病变，并能早期检测良性肿瘤和癌前病变，如胰腺上皮内瘤变(PanINs)和具有进展风险的囊性黏液性病变。随着对微创诊断和治疗的重视，外泌体标志物作为非侵入性方法在胰腺癌的早期诊断、实时监测病情进展和治疗效果以及判断预后方面的临床价值受到越来越多的关注。然而，外泌体广泛存在于包含大量非囊泡大分子结构的体液中，分离纯化方法差异较大，将其作为胰腺癌早期诊断方法应用于临床，仍需行大规模多中心实验，建立标准化且简单易操作的分离纯化技术。外泌体分离新方法的出现以及高通量二代测序技术应用于外泌体检测，可大大提高外泌体生物学标志物早期诊断胰腺癌的准确性。未来需进一步研究来探索外泌体的潜在临床应用，这将会开启胰腺癌诊疗的新时代。