促性腺激素对动物卵母细胞体外成熟中的作用研究进展

张雨阳，金 一

（延边大学农学院，吉林 延吉 133002）

繁殖性能是雌性动物重要的生产力因素。为了提高动物繁殖率，选取生产性状优良的个体进行卵母细胞体外培养技术是必然选择。将卵泡内未成熟卵母细胞取出，在体外特殊条件下进行培养，获得成熟卵子完成体外受精的过程称为卵母细胞体外成熟。一般来说，为了更好地模拟卵母细胞体内成熟的环境并处理好各个成分之间的关系，必须要向培养体系中添加激素。激素是卵母细胞核成熟的最重要调节因子，特别是促性腺激素是哺乳动物体外培养核成熟的主要调节器。促性腺激素包括促甲状腺激素（FSH）和促黄体素（LH），其在卵泡成熟过程中起重要作用，在体内调节卵泡的正常发育和诱导排卵，但在体外培养过程中仍有些机制尚不明确。本文主要综述促性腺激素在卵母细胞体外培养中的作用和在减数分裂过程中的影响，为哺乳动物繁殖育种提供理论依据。

1 卵母细胞体外成熟技术

卵母细胞体外成熟技术的生物学定义是将未成熟的GⅤ期卵母细胞从窦卵泡中取出并在适当的培养体系中培养, 使其可以在体外成熟到MⅡ期。现阶段关于体外成熟与体内成熟之间的研究成果显示，体内成熟卵母细胞与体外成熟卵母细胞发育的胚胎形态动力学没有显著差异，表明体内成熟卵母细胞与体外成熟卵母细胞的胚胎发育潜能可能没有差异[1]。体内和体外成熟卵母细胞的透明带双折射和减数分裂纺锤体差异不显著[2]。此外，体内和体外成熟的卵母细胞显示正常的卵浆，细胞器分布均匀[3]。线粒体形态在成熟条件之间表现出相似性。在体内和体外成熟的卵母细胞中，皮质颗粒通常分层成一排，大部分连续排列在卵浆下方。有人提出预先培养未成熟卵母细胞，使其保持在减数分裂停滞状态，可以改善细胞质成熟，从而提高体外成熟卵母细胞的最终发育能力[4]。因此，研究促性腺激素在卵母细胞减数分裂过程中的作用，能为卵母细胞体外培养改善细胞质提高卵母发育能力提供理论依据。

2 促性腺激素在卵母细胞体外成熟过程中作用

2.1 促卵泡素

促卵泡素（FSH）是决定卵泡在培养中存活和生长的主要激素。FSH有利于促进卵母细胞的成熟和质量，导致更高的胚胎卵裂率和更低的妊娠损失率[5]。理论上，在卵泡或黄体阶段开始时使用卵泡刺激素引发可以增强体内未成熟卵母细胞的卵泡发育和成熟能力[6]。卵母细胞存活率与激素添加量之间存在时间依赖性，培养后期向培养基中添加FSH 会导致活卵泡数量的减少。在体外培养过程中，卵泡存活率对培养基中FSH 浓度的依赖不明显，但有实验数据表明，卵泡生长在激素含量高的培养基中更强烈[7]。Kreeger 等在试验结果表明，含FSH 10 和25 mU·mL-1的培养基中培养的卵泡直径明显大于含FSH 0 或5 mU·mL-1的培养基中培养的卵泡直径，FSH 剂量的增加也增加了乳酸的积累，这表明激活了颗粒细胞代谢。然而，非常高剂量的FSH（50 mU·mL-1）导致卵泡存活率下降，因为代谢产物积累得太快[8]。研究证实，无论卵母细胞数量多少，随着FSH 剂量的增加，活产率都显著降低[9]。

2.2 促黄体生成素

促黄体生成素（LH）在卵泡成熟过程中起重要作用。LH 总是存在于体内通过获得足以使卵泡成熟的浓度来刺激体内的卵泡生成[10]。LH 刺激卵泡细胞的雄激素合成[11]。LH 并没有被认为是培养基的必要成分，但目前正在积极讨论其对体外卵泡生长的影响的问题[12]。

LH 峰激活负责卵丘细胞外基质形成和稳定的基因，即激活卵母细胞的窦状卵泡壁区域。LH 峰导致卵丘细胞中表皮生长因子（EGF）家族基因（Areg、Ereg 和BTC）表达迅速增加。这些配体是完整的膜蛋白，通过胞外裂解从细胞表面释放出来。然后这些配体与EGF 受体（EGFR）结合并激活受体。此外，这种结合导致丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）3 和MAPK1 的激活，也被分别称为细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）。ERK1/2可刺激卵母细胞成熟。然而，EGF网络和ERK1/2在排卵调节、卵母细胞成熟和进一步卵泡黄素化中的具体作用还不够清楚[13-14]。

LH 对卵泡体外成熟影响的研究表明，在添加LH的培养基中，卵泡存活率明显高于不添加LH的培养基。在低剂量LH 的培养基中培养的卵泡比在高LH 浓度的培养基中培养的卵泡直径更大[15]。当LH 浓度＞5 U·L-1时，颗粒细胞增殖受到抑制，卵泡发生闭锁或黄素化。此外，由于LHCGR mRNA的加速降解，高水平的LH 导致LHCGR 的产量和敏感性下降[16]。促性腺激素刺激引起孕激素受体发生变化，加速子宫内膜的成熟；高水平的FSH 或雌激素可能增加颗粒细胞对LH 的敏感性。这种变化使黄体生成素即使在低LH 水平下也能被诱导。黄体化导致子宫内膜的早期成熟[17]。

3 促性腺激素与卵母细胞减数分裂的关系

卵泡生长发育过程中，FSH 和LH 与颗粒细胞上的受体结合并激活环腺苷酸系统（cAMP），cAMP通过诱导卵母细胞pKa依赖性磷酸化细胞周期蛋白依赖性激酶1抑制减数分裂促进因子的活性而维持减数分裂停止[18]。FSH 诱导卵丘细胞扩散，暂时性抑制卵母细胞减数分裂，促进细胞质成熟，随后LH 形成排卵峰，使颗粒细胞中cAMP 的含量上升，卵母细胞中cAMP 含量下降，减数分裂恢复，诱导卵母细胞成熟，卵丘细胞数量增加，卵泡破裂和黄体化[19]。一旦诱导卵母细胞成熟会产生一系列复杂的分子和结构事件，从减数分裂和生发泡破裂的恢复开始，最终在减数分裂的第2个中期阻止卵母细胞。

LH在体内成熟过程中降低了颗粒细胞中NPPC和NPR2 的含量，继而导致cGMP 水平下降，引起MPF 活化，恢复了减数分裂[20-21]。颗粒cGMP 浓度的降低促进cGMP 通过缝隙连接从卵母细胞和卵丘细胞向外颗粒细胞层扩散，使cGMP 浓度在卵泡内均匀降低[22-23]。卵内cGMP含量过低从而导致卵母细胞PDE3A活化、cAMP水解、PKA失活和MPF激活使卵母细胞减数分裂恢复[24]。但在体外培养的小鼠壁颗粒细胞中，LH 不能引起NPPCmRNA 和cGMP含量降低[25]。而FSH 在体外培养卵泡时能起到类似于LH在卵母细胞体内成熟中的作用，下调NPPC含量[26]。也有试验表明，FSH主要通过E2 及其受体间接促进了颗粒细胞中NPPC 的表达发挥作用[27]。此外，FSH调节卵母细胞的翻译是通过EGFR[28]。

FSH 和LH 相应的受体与相匹配的配子结合后通过颗粒细胞中的cAMP 通路转导产生不一样的结果。一种假设是FSH 受体、LH 受体与其他信号通路耦联，导致产生不同结果，另一种假设是FSH和LH 刺激颗粒细胞时cAMP 的特性和传播产生不同作用[29]。因此促性腺激素在cAMP 通路中对卵母细胞减数分裂的作用机制还需要深入研究。

4 小 结

卵母细胞体外培养是一项很有前途的技术，但目前还不能满足当前生产实验的需要。选择获得体外成熟卵母细胞所需的最佳卵泡培养条件需要一个复杂的方法，需要考虑细胞的机械和化学环境、新陈代谢和旁分泌相互作用[30-31]。为了获得更多的成熟卵母细胞，需要用对卵泡正常生长和发育至关重要的因素（包括促性腺激素）进行研究。在大多数研究中，FSH 是在整个培养过程中添加到培养基中的，而具有LH 活性的药物仅在培养结束时添加。在少数的几项研究中，为了要保持卵泡的正常生长和发育，研究人员不仅在培养结束时向培养基中添加LH 以刺激排卵，还在非常早期阶段添加了LH。因此，正确应用促性腺激素可以在体外模拟体内条件。研究促性腺激素对卵母细胞减数分裂停滞的维持作用对卵泡生长和发育的影响仍然是许多研究人员面临的主要问题。