血小板表面N糖β1，6-GlcNAc分支缺陷诱导骨髓源性巨噬细胞表型M1转化

蔡惠丽 邹雅倩 周 蜜 王勃霏 易 虹 王树林 郭静明

(三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 血液内科 & 三峡大学 血液病研究所， 湖北 宜昌 443003； 2. 三峡大学 第一临床医学院[宜昌市中心人民医院] 脊柱外科， 湖北 宜昌 443003)

原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一种获得性自身免疫性疾病，约占临床出血性疾病的1/3，其特征是原因不明的单纯血小板减少[1, 2]，迄今为止其发病机制尚未完全阐明。目前学者普遍认为机体免疫功能紊乱在ITP发生发展过程中发挥核心作用[3]。

蛋白质糖基化是蛋白质翻译后一种重要的修饰过程。糖基化与固有免疫和适应性免疫密切相关，参与免疫细胞的活化与凋亡、抗原的处理与递呈以及补体活化等过程[4, 5]。已有研究证实，ITP患者血小板脱糖基化水平较正常人明显增高，而且ITP的治疗效果与脱糖程度呈负相关，显著脱糖基化的患者可能对传统的药物治疗和脾脏切除术无反应[6, 7]。我们前期研究发现，乳腺癌MA782细胞表面N糖β1，6-GlcNAc分支的表达降低能够诱导骨髓来源的巨噬细胞发生M1型极化，促进免疫炎症反应的发展[8]。同时我们检测了部分ITP患者的血小板标本，发现其表面N糖β1，6-GlcNAc分支的表达水平较正常血小板降低。而ITP血小板N糖支链异常与患者免疫状态的相互关系目前尚未明确。本研究拟通过体外实验探讨N糖β1，6-GlcNAc分支缺陷的血小板对巨噬细胞极化的影响。

1 材料与方法

1.1 小鼠动物模型建立及血小板获取

无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级BALB/c小鼠10只，雌性，体重为(18±2) g，去离子水配置1 mg/mL苦马豆素(Sigma)，5只按照6 mg/kg剂量进行灌胃，1次/d。连续灌胃1周后，眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠。取EDTA抗凝血，室温150 g离心15 min后取上清，获得富含血小板血浆。调整血小板浓度为107/mL。

1.2 血小板表面N糖β1，6-GlcNAc表达水平检测

取以上血小板溶液100 μL，加入FITC-L-PHA (Vector Laboratories) 5 μL，室温孵育30 min，500 μL PBS溶液洗涤1次， 500 μL PBS溶液重悬后上流式细胞仪(BD FACSCanto II)检测，以平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)表示β1，6-GlcNAc相对表达量。

1.3 骨髓来源巨噬细胞获取及培养

参照课题组前期实验方法获取和培养骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages，BMDMs)[8]。培养基的配置方法为DMEM(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中加入2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素、0.37%(wt/vol)NaHCO3、10%热灭活的胎牛血清，再加入10%(vol/vol)的L929细胞培养上清液作为巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)来源。处死正常SPF级BALB/c小鼠， 75%医用酒精浸泡消毒后，在超净工作台内取其股骨及胫骨骨髓内细胞于离心管内，1 000 rpm离心5 min去上清，红细胞裂解液(武汉众一生物)破红，培养液重悬骨髓细胞，加入13 mL培养液转至100 mm培养皿。去除贴壁细胞后，调整细胞浓度为3×105/mL，转至12孔培养板中。在37℃、10%CO2条件下培养5～7 d，隔天更换细胞培养液1次。

1.4 血小板与骨髓来源巨噬细胞共培养

将巨噬细胞与血小板按照1∶20的比例在6孔板中进行共培养，每孔含2×105的巨噬细胞与4×106的血小板，在37℃、10%CO2培养48 h，离心收集上清及巨噬细胞进行后续实验。

1.5 流式细胞术检测巨噬细胞表面分子

将收集的巨噬细胞重悬在含1%胎牛血清的PBS缓冲液中，分别加入10 μL PE-anti-F4/80 (eBioscience)、10 μL PE-anti-CD16/32 (BD Biosciences)、10 μL PE-anti-CD206(BD Biosciences)、10 μL PE-anti-Dectin-1 (BD Biosciences)抗体，孵育30 min，洗涤后常规上流式细胞仪(BD FACSCanto II)检测，以阳性率及MFI表示以上各分子的表达量。

1.6 RT-PCR检测巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶和精氨酸酶1的mRNA水平

TRIZOL法提取细胞总RNA，按照SYBR Green PCR Kit(QIAGEN)说明书方法进行荧光实时定量PCR(Applied Biosystems)检测巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和精氨酸酶1(arginase-1，Arg-1)的mRNA水平。反应条件如下：95℃加热5 min后，95℃加热10 s，59℃退火15 s，72℃延伸20 s，30个循环。引物序列如下：iNOS上游引物5′-CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTG-3′，下游引物5′-GGAGTAG-CCTGTGTGCACCTGGAA-3′；Arg-1上游引物5′-CAGAAGAATGGAAGAGTCAG-3′，下游引物5′-CAGATATGCAGGGAGTCACC-3′；内参GAPDH上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。引物由上海生工合成，以GAPDH为内参进行标准化后得出各组靶基因的相对表达量。

1.7 上清中亚硝酸盐含量测定(Griess法)

取离心后收集的共培养上清100 μL，加入100 μL的Griess试剂(武汉众一生物)，室温放置20 min后，以完全培养基加显色剂作为空白对照，酶标仪(Thermo)540 nm处测定各孔的吸光度值，每组试验重复3次。

1.8 巨噬细胞中精氨酸酶活性测定

将收集的巨噬细胞用PBS溶液洗涤，按照精氨酸酶测定试剂盒(Arginase Activity Assay Kit)操作说明，调整各组细胞数为1×106个，测定各组精氨酸酶活性(结果以尿素浓度表示)。每组试验重复3次。

1.9 白介素-10及肿瘤坏死因子-ɑ含量测定

按照ELISA kit (eBioscience)说明书方法，测定各组上清中白介素(interleukin，IL)-10及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-ɑ含量。

1.10 统计分析

各组实验数据来自3次实验的平均值，表示为平均值±标准误，采用GraphPad Prism 5.0统计作图软件进行统计分析，两组比较采用t检验，多组比较采用方差分析，P<0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建β1，6-GlcNAc分支表达缺陷血小板

FITC-L-PHA凝集素结合试验结果显示，苦马豆素灌胃后小鼠体内血小板表面β1，6-GlcNAc分支表达较正常小鼠明显降低(见图1)，表明本实验成功构建β1，6-GlcNAc分支表达缺陷血小板，可用于后续实验。

2.2 β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板诱导BMDMs中iNOS表达

按照课题组前期的实验方法，我们成功诱导培养出小鼠BMDMs，流式细胞术检测显示巨噬细胞表面特异性分子F4/80表达阳性率达93%，表明该巨噬细胞可用于后续实验。RT-PCR检测结果显示，BMDMs与β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板共培养后，其iNOS mRNA表达水平较正常对照组增加，而Arg-1 mRNA表达水平较正常对照组降低，差异均具有统计学意义(见图2，均P<0.001)。另外，BMDMs与β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板共培养后，其Arg-1 活性(反映为尿素浓度)较正常对照组降低(见图3A，P=0.000 3)，而其iNOS活性(反映为培养基上清中亚硝酸盐的含量)较对照组显著增加，差异具有统计学意义(见图3B，P=0.012 8)。

2.3 β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板诱导BMDMs表面CD16/32表达

流式细胞术检测结果表明，与β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板共培养后，BMDMs表面分子CD16/32的平均荧光强度较对照组明显升高，而CD206及Dectin-1表达下调，差异均具有统计学意义(见图4，均P<0.05)。

2.4 β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板调节BMDMs表达TNF-ɑ与IL-10

ELISA法检测结果表明，与β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板共孵育后，BMDMs培养上清中TNF-ɑ的含量较对照组升高，IL-10的含量较对照组降低，其差异均具有统计学意义(见图5，均P<0.05)

3 讨论

蛋白质糖基化是蛋白质翻译后的一种重要修饰，N-乙酰氨基糖基转移酶(N-acetylglucosamine transferase，简称GnT)是N-糖链合成的的中心环节，其中N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V，简称GnT-V 或Mgat5，是合成N-糖链β1，6-GlcNAc 分支的关键酶。由于血小板结构的特殊性(无细胞核)，我们无法通过RNAi技术沉默Mgat5的表达从而获得β1，6-GlcNAc 糖链分支表达缺陷的血小板。苦马豆素作为高尔基复合体内ɑ-甘露糖苷酶II的抑制剂，一直是研究糖蛋白N-连接寡糖合成的工具药，近年来也发现其具有良好的抗肿瘤效应[9]。苦马豆素作用于Mgat5催化的上游阶段，能够导致β1，6-GlcNAc 糖链分支表达缺陷。本研究中我们通过苦马豆素灌胃动物模型[10]获取了N糖链表达缺陷的血小板。通过L-PHA凝集素结合实验表明，我们所获取的血小板表面β1，6-GlcNAc 分支表达水平明显较正常组降低，可用于后续实验。

巨噬细胞是一类在体内发挥重要免疫效应的细胞，为机体稳态维持和组织防御提供保障。一方面可以通过吞噬作用直接降解病原微生物和异源物质，另一方面可通过与多种其他免疫细胞如NK细胞、T细胞相互作用而进一步发挥防御功能。巨噬细胞的极化可以分为M1型和M2型两大类，其中M1型巨噬细胞，也称经典活化型巨噬细胞，具有很强的致炎和微生物杀伤作用，并可促进IL-12等炎性因子介导的Thl细胞应答；而M2型巨噬细胞则支持Th2细胞相关的效应功能，具有组织修复和免疫调节的作用；并且随着巨噬细胞活化状态的变化，保护性的Th2型细胞可向Thl型细胞转变[11]。目前对于巨噬细胞的极化检测，尚无单一的特异性标志，一般从巨噬细胞表面分子表达、分泌细胞因子、iNOS及Arg-1的表达等多个方面综合判定。本实验中，BMDMs经过培养后表面巨噬细胞特异性分子F4/80表达显著增高，表明BMDMs的培养获得成功。BMDMs与β1，6-GlcNAc分支表达缺陷的血小板共同孵育后，巨噬细胞表面CD16/32表达、iNOS mRNA表达、培养上清中TNF-ɑ的表达都较对照组明显升高，这表明β1，6-GlcNAc分支表达缺陷的血小板能够诱导BMDMs体外发生M1型极化。

ITP患者血小板表面N糖链β1，6-GlcNAc分支表达缺陷和ITP发生发展的相互关系目前尚不明确。有研究显示，Mgat5基因敲除的小鼠(Mgat5-/-小鼠)因β1，6-GlcNAc支链表达缺陷易发生自身免疫疾病，如系统性红斑狼疮、实验性自身免疫性脑炎、肾炎、糖尿病和多发性硬化等，且迟发型超敏反应增强[12-14]。而且，N-糖β1，6GlcNAc分支表达水平与自身免疫性疾病的易感性呈负相关[14]，该现象可能与TCR活化阈值下降、Th1细胞向Th2细胞极化及巨噬细胞活化等相关[4, 15]。ITP作为一种自身免疫性疾病，越来越多的证据表明，蛋白质的糖基化水平异常在ITP的发病过程中也发挥着重要作用。如前所述，ITP患者血小板脱糖基化水平较正常人明显增高，ITP的治疗效果与脱糖程度呈负相关[6, 7]。有文献报道，ITP血小板膜糖蛋白去唾液酸化暴露糖链上的半乳糖(Gal)或进一步脱半乳糖残基暴露N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基，分别与肝细胞上的AMR受体(ashwell-morell receptors)及巨噬细胞上的ɑMβ2(MAC-1)受体结合而被吞噬清除[16]。有ITP患者采用抗病毒药物奥司他韦(亦是一种唾液酸酶抑制剂)治疗后血小板计数恢复正常[17]。以上研究结果均证实了非Fc受体依赖的血小板破坏理论，也表明了蛋白质糖基化水平异常与ITP的发生发展关系密切[18，19]。

本实验采用β1，6-GlcNAc 分支表达缺陷的血小板与BMDMs体外共同孵育后发现巨噬细胞发生了M1型极化，但M1型巨噬细胞后续如何影响机体免疫功能，其是否参与ITP的发生过程，巨噬细胞的M1型极化是否是ITP的始动因素等问题，尚待进一步研究。