响应面法优化牛蒡根总黄酮的提取工艺①

王文婷， 肖慧敏， 冯 凡， 韩方凯， 封其虎

(宿州学院生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000)

0 引 言

牛蒡在我国主要分布于东北、西北、安徽、浙江等地，在医学上有广泛应用，具有治疗感冒、头痛、咳嗽等疾病的作用[1]。牛蒡除了可以药用，还能够作为保健食品，其营养价值很高，富含矿物元素和氨基酸，因此被人们称为蔬菜之王[2]。近年来，在功能性食品需求量不断增加的环境下，人们对药食性动植物的研究范围不断扩大，而兼具药用性和食用性的牛蒡根也得到研究人员的重视[3]。牛蒡根是牛蒡的根部，在日常生活中，牛蒡根被作为保健蔬菜，具有降血糖、抗衰老、提高免疫力等作用[3-5]。目前，有关牛蒡根的研究也越来越多，发现牛蒡根中含有黄酮类、多糖类等活性成分，具有较高的自由基清除力，能够抗氧化，同时有抑菌、消炎的作用，进一步提高了其药用价值[4-6]。采用冷凝回流法提取牛蒡根中的总黄酮，为得到最佳提取工艺，以响应面法进行优化，为系统开发牛蒡根中的活性成分并提高其应用价值提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂

牛蒡根：市售，新鲜，无破损及病虫害。

NaNO2,Al(NO3)3,NaOH，CH3CH2OH等(西陇化工，均为分析纯)。

1.2 主要仪器、设备

ME-T分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；RE-5000型旋转蒸发器(耀特仪器设备(上海)有限公司)；JYS-M01型粉碎研磨机(九阳股份有限公司)；DHG-9245A型电热鼓风干燥箱(一恒科学仪器(上海)有限公司)；UV-5300型紫外可见分光光度计(元析仪器(上海)有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型真空泵(巩义予华仪器有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 牛蒡根总黄酮提取工艺

原料预处理：牛蒡根清洗、沥干，切成小片，60℃烘干，粉碎以备用。

提取：准确称量4 g牛蒡根粉，加入适量一定浓度的乙醇溶液，将水浴锅调至一定的温度，冷凝回流提取一定的时间，待提取完成后抽滤，收集滤液，浓缩后溶解、定容，得牛蒡根总黄酮提取液[7]。

1.3.2 单因素试验设计

在各单因素试验中，分别准确称量6份牛蒡根粉4 g，置于圆底烧瓶中。设定料液比(g/mL)1:10，在90℃进行冷凝回流提取2.5h，探究分析不同乙醇溶液浓度(30%,40%,50%,60%,70%,80%)对总黄酮提取效果的影响；设定料液比1:10、乙醇溶液浓度40%，进行冷凝回流提取2.5h，探究分析不同提取温度(50℃,60℃,70℃,80℃,90℃,100℃)对总黄酮提取效果的影响；设定乙醇溶液浓度40%，在90℃进行冷凝回流提取2.5h，探究分析不同料液比(1:5,1:10,1:20,1:30,1:40,1:50)对总黄酮提取效果的影响；设定料液比1:10、乙醇溶液浓度40%，在90℃进行冷凝回流提取，探究分析不同提取时间(1 h,1.5 h,2 h,2.5 h,3 h,3.5 h)对总黄酮提取效果的影响。

1.3.3 响应面法优化试验设计

利用Box-Behnken设计原理进行响应面优化，得到最佳提取条件。由于料液比对总黄酮提取效果无显著影响，故选择另外三个因素：提取温度、乙醇溶液浓度、提取时间作为考察条件，以黄酮提取率作为响应值进行分析[7-9]。试验因素及水平如表1。

表1 试验因素水平

1.3.4 牛蒡根总黄酮提取率的测定

1.3.4.1 芦丁标准曲线的绘制

采用NaNO2-Al(NO3)3法测定[8,9]。以浓度(mg/mL)为横坐标x，吸光度值为纵坐标y，得标准曲线方程为：

y=10.441x+0.0047(R2=0.9994)。

1.3.4.2 样液总黄酮浓度的测定

将上述提取液稀释10倍，准确移取1 mL于25 mL容量瓶中，依据标准曲线的绘制步骤进行操作，测得吸光度，再根据标准曲线方程计算所测定的稀释后样液的牛蒡根总黄酮浓度。

1.3.4.3 总黄酮提取率的计算

式中，X：总黄酮提取率(mg/g)；M：称取的牛蒡根粉样品质量(g)；c：稀释后样液总黄酮浓度(mg/mL)；V：牛蒡根粉样品提取液总体积(mL)；n：稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 乙醇溶液浓度对牛蒡根总黄酮提取的影响

由图1可见，当乙醇溶液浓度在30%-40%范围时，牛蒡根总黄酮的提取率随浓度增大而不断升高，浓度高于40%时，提取率呈现下降趋势。这可能是因为牛蒡根中黄酮类化合物主要以黄酮苷的形式存在，而较低浓度的乙醇溶液适合黄酮苷的提取，较高浓度的乙醇溶液适合黄酮苷元的提取[10]。因此，牛蒡根总黄酮提取的最佳乙醇溶液浓度为40%。

图1 乙醇溶液浓度对牛蒡根总黄酮提取的影响

2.1.2 提取温度对牛蒡根总黄酮提取的影响

由图2可见，温度处于50℃-90℃范围时，牛蒡根总黄酮提取率随温度上升而不断增加，当温度在90℃时，提取效果最好，当温度继续上升至100℃时，提取率有所降低，提取效果受到抑制。可能的原因是较低温度时，升高温度利于分子扩散从而提高黄酮类物质的溶解，但到达90℃后继续使温度升高，高温会导致其稳定性有所下降，结构被破坏，发生分解，造成提取率下降[11]。因此，牛蒡根总黄酮最佳的提取温度为90℃。

图2 提取温度对牛蒡根总黄酮提取的影响

2.1.3 料液比对牛蒡根总黄酮提取的影响

由图3可见，牛蒡根总黄酮提取率随提取剂的增加呈现先上升后下降的趋势，但在一定范围内，料液比对提取率并无太大影响，总体影响效果不明显。在料液比为1:10时，牛蒡根总黄酮提取率达最大值，因此选择该比例为最佳料液比，且在响应面优化试验中不将该因素列为操作条件进行研究。

图3 料液比对牛蒡根总黄酮提取的影响

2.1.4 提取时间对牛蒡根总黄酮提取的影响

由图4可见，当提取时间在1.0h-2.5h范围内时，牛蒡根总黄酮提取率随时间增加而升高，且在2.0h-2.5h范围内上升非常明显，但当时间超过2.5 h后，提取率在一定的范围内维持稳定，说明已经提取完全，时间继续延长对提取影响不明显[9]。因此，牛蒡根总黄酮最佳的提取时间为2.5 h。

图4 提取时间对牛蒡根总黄酮提取的影响

2.2 响应面优化试验结果分析

2.2.1 回归模型分析

响应面优化设计和结果如表2所示，对数据进行多项拟合回归，得到Y(黄酮提取率)对A(乙醇溶液浓度)、B(提取温度)、C(提取时间)的二次多项式回归模型：Y=5.67-0.030A-0.074B+0.21C+0.075AB-0.055AC+0.17BC-0.39A2-0.57B2-0.39C2。将回归模型进行方差分析，结果如表3所示。从表3可以看出，响应面试验设计整体模型P值小于0.0002(具有极显著差异)，失拟项P值为0.2686(不具有显著差异)，说明方程对试验有较好的拟合性。此外，提取时间(C)对牛蒡根总黄酮提取率有极显著的影响，提取温度(B)与提取时间(C)的交互作用对牛蒡根总黄酮提取率的影响显著，各因素的二项式影响均极显著。从数据得出R2=0.9682，说明Y的变化有96.82%与A、B、C有关，拟合度较好。回归方程能够较好地描述响应面值因素之间的关系，该试验方法可靠[12]。

表2 响应面优化设计和结果

表3 回归模型方差分析结果

2.2.2 响应面分析

通过试验分析得到不同因素交互作用对牛蒡根总黄酮提取影响的响应面三维图，如图 5 所示。曲面比较弯曲陡峭代表操作条件对Y值影响很大；曲面相对平缓代表操作条件对Y值影响偏小[12,13]。因此，不同因素交互作用对提取率影响程度为：提取温度(B)与提取时间(C)交互作用>乙醇溶液浓度(A)与提取温度(B)交互作用>乙醇溶液浓度(A)与提取时间(C)交互作用。同时，三个因素对牛蒡根总黄酮提取率的影响程度为：提取时间(C)>提取温度(B)>乙醇溶液浓度(A)。这与回归模型方差分析结果吻合。通过响应面分析，预测得到最佳的提取牛蒡根总黄酮的工艺为料液比1:10、乙醇溶液浓度39%的条件下，在温度 88℃提取2.6 h，此时提取率为5.903 mg/g。于最佳工艺条件下提取牛蒡根总黄酮，进行验证试验，测得提取率为5.914 mg/g，符合预期值。

图5 不同因素交互作用对牛蒡根总黄酮提取影响的响应面三维图

3 结 论

通过冷凝回流法，采用单因素与响应面优化试验得到牛蒡根总黄酮提取的最佳工艺：料液比(g/mL)1:10、乙醇溶液浓度39%、提取温度88℃、提取时间2.6 h，牛蒡根总黄酮提取率达5.914 mg/g。这为牛蒡根中活性成分黄酮类化合物的提取与利用提供了理论依据，对其相关性质的研究也有待更深入的探索。