急性胰腺炎动物模型构建方法的研究

凤振宁，金世柱

哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科，黑龙江 哈尔滨 150081

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是一种由多种原因引起胰腺组织自我消化的无菌性、化学性炎症反应，临床症状可表现为剧烈腹痛、腹胀、恶心、呕吐及发热等。实验室检查提示血清中淀粉酶和脂肪酶水平显著升高，组织活检可见胰腺腺泡细胞的坏死[1-4]。引起AP的原因有很多，其中以过量饮酒和胆石症最为常见[1-3]，过量饮酒占所有病例的15%～66%，胆石症为26%～51%。引起AP的其他原因还包括高血脂、自身免疫性疾病、医源性、糖尿病、肥胖等[3]。近年来AP的发病率逐年升高[1,4]，在欧美发达国家为4.9/10万～80/10万，是消化科常见的住院病例，总体死亡率为2%～5%，有并发症者死亡率可达50%。AP被分为轻度、中度重症、重症，其中重症急性胰腺炎(SAP)的死亡率为30%～50%[1, 4]，多器官功能障碍(MODS)可能是SAP患者死亡的最主要原因[5]，是由于IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的大量释放引起的。AP的高死亡率、高住院费用是由于其发病机制尚不明确，缺乏有效的预防及治疗策略。因而研究AP的发病机制、药物治疗极其重要，而临床研究尚存在伦理争议，动物模型则可以很好地模拟AP的发病过程，为研究其发病机制、药物治疗、预防护理等提供很好的研究工具。

1 动物模型

理想的动物模型应该有以下几点优势：构建简单、易复制、过程可控，能够很好地模拟人类疾病。近几十年来，研究者开发了多种AP动物模型，并以此在阐明AP的细胞生物学和病理生理学机制方面取得了很大进展。目前常用于构建AP动物模型的方法包括：碱性氨基酸[L-精氨酸(L-Arginine, L-Arg)、L-鸟氨酸]、促分泌素、酒精和逆行注射胆汁酸等。

1.1 碱性氨基酸诱导AP动物模型生理条件下，胰腺大量摄取氨基酸以合成胰酶，但高浓度氨基酸聚集会破坏胰腺外分泌腺，诱发AP。L-Arg是应用较为广泛的用于诱导AP动物模型的碱性氨基酸。L-Arg诱导AP动物模型，通常剂量为2.5～5.0 g/kg L-Arg腹腔注射[6-7]，较高剂量可引起高死亡率，减少剂量会延缓AP的发病时间，重复给药可促进胰腺组织坏死。Zhang等[6]以L-Arg(2.5 g/kg)腹腔注射，可成功诱导大鼠AP模型，并发现AP模型中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平明显升高。El-ashmawy等[7]以3.0 g/kg L-Arg腹腔注射成功诱导大鼠AP模型，24 h后处死大鼠，可发现胰腺组织有明显的炎细胞浸润，伴有严重的组织水肿和血管充血肿胀。AP大鼠模型常用L-Arg浓度为30%，而这种高浓度的L-Arg会造成小鼠模型较高的死亡率[8]。董芳等[9]研究显示，L-Arg(4.0 g/kg，8%)腹腔注射可成功诱导小鼠坏死性胰腺炎模型，在造模4 d后胰腺细胞坏死仍较为明显。对于小鼠而言，L-Arg的有效和致死剂量非常接近，而且不同品系小鼠构建模型所需L-Arg的浓度、剂量也不相同。有研究报道[8]，不同浓度L-Arg对小鼠的作用并不相同，不同品系小鼠对L-Arg的敏感性也不同，L-Arg(2.5～3.0 g/kg，5%～10%)诱导AP小鼠模型时发现FVB/n、C57BL/6小鼠的胰腺组织坏死率明显高于BALB/c小鼠，其原因有待进一步研究。L-Arg诱导AP模型暂无明确的机制，研究显示可能是由于L-Arg诱导生成大量氧自由基，从而破坏酶原颗粒的稳定性，导致大量消化酶释放，同时提高NO及炎性介质的水平[7]。此外,通过L-Arg-AP模型进行研究[10]，发现胰腺外分泌腺细胞线粒体功能障碍可能是此类模型成功的核心机制，研究显示,L-Arg会导致胰腺线粒体不可逆损伤，而在雨蛙肽(Caerulin,CAE)和牛磺胆酸钠模型中这种线粒体的损伤是可逆的。Ren等[11]研究也显示,线粒体功能障碍在AP的发病机制中起着至关重要的作用，通过给予实验动物外源性鸢尾素改善线粒体功能，可以增加实验动物的存活率并减轻胰腺组织的损伤。L-Arg诱导的AP模型具有较高的重复性和适用性，应用较为广泛，稳定性较强。主要缺点是临床相关性较低，仅有少数病例报道L-Arg所致人类AP[12]。

L-赖氨酸也被用于诱导AP动物模型，研究显示[13],腹腔注射L-赖氨酸(2.0 g/kg)可以有效诱导大鼠SAP模型，胰腺腺泡细胞在处理12 h开始明显坏死，其机制可能与L-赖氨酸选择性损伤胰腺线粒体导致细胞凋亡有关。此外,还有L-组氨酸(4.0 g/kg)诱导的AP动物模型[14]，胰腺损伤在24 h达到峰值但重复性和适用性尚不清楚。

1.2 促分泌素诱导AP动物模型正常胰腺的代谢与促分泌素的生理浓度相关，AP是由于促胰液素大量分泌，导致胰腺消化酶分泌过多，引起胰腺自身消化。促分泌素模型最常使用的是CAE，它是一种含有14个氨基酸残基的十肽缩胆囊素(CCK)类似物，可以刺激胃肠道激素分泌。CAE通常用于诱导轻度AP模型[15]，此类AP模型的构建方法通常为腹腔注射CAE(50 μg/kg)，每次注射间隔为1 h，一般注射6～7次。研究[16]通过连续腹腔注射CAE(50 μg/kg)7次，可发现胰腺明显水肿、炎细胞浸润、胰腺组织坏死，并以双氯芬酸钠干预治疗，发现可以明显改善CAE诱导的AP引起的肺水肿。Hou等[17]以CAE联合LPS构建SAP模型，实验方法为腹腔注射CAE (50 μg/kg)共12次，间隔时间为1 h，最后补充注射一次LPS(15 mg/kg)，发现胰腺组织出血水肿，可见大量炎细胞浸润。与单纯应用CAE相比，联合其他药物诱导后，实验动物的胰腺损伤更明显。目前CAE诱导AP的作用机制并不明确，可能由于CAE作用于CCK受体，大量胰蛋白酶原被激活为胰蛋白酶，进而导致了胰腺的自我消化。CAE诱导快、模型重复性高、适用性广、稳定性强，此模型经常用于评价AP的全身系统改变。这种模型的主要缺点是单纯应用CAE多诱导产生轻度AP模型，临床相关性有限。

1.3 酒精诱导AP动物模型虽然大量饮酒是引起人类AP的主要原因之一，但动物实验[18]发现，酒精单独应用(静脉注射或灌喂)，不会使实验动物的胰腺组织出现明显的水肿、炎细胞浸润、组织坏死等，仅能引起胰腺的微循环障碍。有学者[19]用25%乙醇(5 g/kg)饲喂C57BL/6小鼠连续10 d，才会引起胰腺水肿、中度的纤维化和腺泡萎缩。这些研究均表明了单独应用酒精来处理实验动物难以构建AP动物模型。酒精源性胰腺炎不单纯依靠乙醇的刺激，可能需要其他因素刺激胰腺组织过度分泌。有研究[20]通过腹腔注射乙醇(1.32 g/kg)和棕榈油酸(1.5 mg/kg)2次/h，24 h可引起实验动物AP的发生。其机制可能是由于棕榈油酸和乙醇在胰腺中结合生成脂肪酸乙酯，脂肪酸乙酯是引起AP的一类重要致病毒素，促进钙离子的大量释放导致腺泡细胞钙超载，使线粒体功能障碍甚至大量坏死，诱导产生AP。酒精源性AP模型虽然成本低廉、操作简单，但需要与外分泌过度刺激相结合时，才能诱导AP。

1.4 胰胆管注射胆盐诱导AP动物模型此模型通常应用牛磺胆酸钠(sodium taurocholate, ST)诱导产生AP模型，构建方法[21-22]通常为开腹并切开十二指肠前壁，由十二指肠壶腹部向胰管注射胆盐，24 h内即可成功诱导SAP模型。 Lin等[22]将5% ST(1 ml/kg)通过0.45 mm直径的聚乙烯导管逆行注射到SD大鼠胰胆管中，以0.04 ml/min的速度持续泵入共10 min，可以观察到胰腺组织水肿、出血、腺泡坏死和炎性细胞浸润。并以此模型研究发现间充质干细胞可以减轻胰腺炎性渗出和组织损伤，减少脑微血管内皮细胞凋亡，显著降低大鼠血脑屏障的通透性，减少了继发性脑水肿的发生。此模型经过改良后，可将十二指肠切开改为十二指肠穿刺置管[23]，减少了手术创伤带来的肠道及局部血管损伤。另外该模型在大型动物实验中也被成功复制，有学者[24]通过逆行胰胆管造影术在高压下(100 mmHg)将10 ml浓度为10%和20%的ST注入主胰管诱导产生SAP模型，且胰腺损伤程度与ST呈正相关。Le等[25]以2.5%～5.0% ST(10 μl/min，5 min)诱导AP小鼠模型时，同时结扎了小鼠的胆总管，组织切片显示大量腺泡坏死和炎性细胞浸润。Cen 等[23]以3.5% ST(2 ml/kg)建立了SAP大鼠模型，并以青蒿琥酯干预，发现青蒿琥酯显著增加SAP大鼠的存活率，并降低血清淀粉酶和脂肪酶活性，减少IL-1β和IL-6的释放。同时发现青蒿琥酯降低了Toll样受体-4(TLR-4)和NF-κB mRNA的表达，显示青蒿琥酯可能抑制了TLR-4/NF-κB这一信号通路，以降低消化酶的活性和促炎因子的表达。 因此，青蒿琥酯可作为潜在治疗药物用于研究SAP的治疗。

ST诱导AP是最常用诱导方法之一，模拟了胆总管下段梗阻，临床相关性高，与胆源性胰腺炎的发病过程类似。这种模型多伴有多器官功能衰竭，适用于研究AP的局部和全身并发症，可为研究SAP的靶向治疗提供工具。此类模型的缺点是死亡率较高，且无法评估注射液引起胰胆管压力变化对AP的影响。

1.5 胰管结扎诱导AP动物模型有研究通过结扎胰管构建AP模型[26]，在结扎后第3天胰腺组织可出现炎性渗出、淋巴浆细胞浸润、间质水肿、间质纤维化和成纤维细胞增多，在第7天达到高峰。与人胰腺炎相似，在该模型中过氧化物和NO合酶表达被上调。该模型的优点是避免了外源性药物的应用引起全身反应，避免了外源性药物对AP自然病程的影响。

1.6 其他方法除以上方法外，还有胰腺被膜下注射法，该模型虽然可以快速建立AP模型，但临床相关性低。还有无胆盐乙硫氨酸模型，该模型价格昂贵，且仅在雌性小鼠诱导出AP。另外还有电刺激法、高钙血症法和高脂血症性AP模型等。

2 展望

AP动物模型广泛使用数十年，大多具有重复性良好、模型稳定等优点，但基本均具有剂量、浓度和时间依赖性，且致病机制各不相同。研究者可根据自身的研究需求，选择合适稳定的AP模型。也可不断改良现有的实验方法，探索更符合人AP发病机制的模型。此外，转基因动物模型也越来越多地用于各种疾病的研究，研究者可探索AP转基因动物模型，以研究遗传因素等对AP的影响。虽然AP动物模型的临床相关性尚存在争议，但它们使人类对于AP的病理生理机制的认识更加深入。在未来的研究中，动物模型将继续成为研究AP不可或缺的工具。