多发性硬化的干细胞治疗进展

徐艳芳，张金文

1 多发性硬化简介

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种由 T细胞介导的中枢神经系统炎症性疾病，主要累及脊髓和大脑白质，伴有神经脱髓鞘、轴突丧失并导致不可逆残疾，以年轻群体多发。作为最为常见的神经系统疾病之一，MS是年轻患者非创伤性神经性残疾的首要病因。

1.1 MS发病机制 MS涉及中枢神经系统的慢性炎症性脱髓鞘、少突胶质细胞的丧失、髓鞘再生。MS的主要病理过程包括炎症阶段和退行性病变阶段。

神经病理学证据表明，MS病变中最早的病理变化是在没有淋巴细胞浸润情况下的少突胶质细胞凋亡和小胶质细胞激活，伴有继发性脱髓鞘［1］。MS患者的残疾是由抗原特异性免疫应答介导的炎症反应引起的。而脱髓鞘病变中存在炎症细胞及其分泌的分子，髓鞘抗原反应的致病性T细胞在MS中起关键作用，导致神经元退化。基质金属蛋白酶（MMPs）［2］介导自身反应性T细胞向中枢神经系统的迁移导致中枢神经元及其髓鞘的破坏。氧化应激、缺氧和脑的低灌注可导致MS中脱髓鞘病变增加［3，4］。 MS 具有遗传易感性。 遗传学研究证实，MHC classⅡHLA-DRB1基因 HLA-DRB1＊15：01是MS发展的最重要危险因素，使疾病风险增加3 倍［5］。

1.2 MS动物模型 MS动物模型包括实验性自身免疫/过敏性脑脊髓炎（EAE）模型、病毒诱导的慢性脱髓鞘疾病模型［主要为Theiler小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）感染模型］、毒素诱导脱髓鞘模型三种。单一的动物模型不能完全复制人类MS的整个异质性及其在临床和放射学表现中的多样性，也不可能充分表现MS的所有临床、放射学、病理学和遗传学特征。目前开发出的MS动物模型仅代表MS的某个或某些方面，需要根据具体的研究问题，合理选择动物模型。

2 MS与自体造血干细胞（I/AHSCT）

I/AHSCT治疗MS是利用免疫清除剂 （预处理方案）耗尽自身反应性效应细胞，然后输注自体造血干细胞重建正常免疫功能系统。I/AHSCT治疗后，循环自身反应性效应T细胞Th17减少，新的胸腺T细胞出现，调节环境恢复［6］。重建的T细胞谱系变异程度与预处理方案的强度有关。

2.1 患者选择 I/AHSCT治疗受益对象，早期认为是患有长期严重进行性MS的患者，其炎症特征不突出且神经退行性变是主要的潜在机制。这类患者一般是受益的，但很少见到神经功能改善［7，8］。此外，神经功能障碍严重的患者发生不良事件的风险增加［9］。最近研究则侧重于复发缓解型MS患者，其中具有活性炎症特征的患者受益最大［9］。因此，目前认为I/AHSCT治疗对象是复发缓解型MS患者。

2.2 移植流程 I/AHSCT治疗步骤包括外周血造血干细胞的动员，通过施用预处理方案免疫消融，然后输注造血干细胞以促进血液重建。在MS治疗中，最常用的方法是环磷酰胺（Cy）+G-CSF作为动员剂，这有助于消耗淋巴细胞并减少自体反应性T细胞再输注的概率。

目前预处理方案的最佳强度仍未确定。最常用的预处理方案是BEAM与抗胸腺细胞球蛋白（ATG）相结合［8，13，14］的中等强度方案，高强度方案因为毒性太强而被诟病。Atkins等［15］使用了高强度方案——高剂量白消安和Cy（Bu/Cy）输注方案［15］并对白消安方案进行了几项修改以提高耐受性。相反，Burt及其同事［7］提倡抗胸腺细胞球蛋白治疗后给予Cy的低强度方案，效果良好、毒性降低且无病死率。

2.3 结果量化 MS临床试验中最常发生的不良结果是复发、残疾加重，量化工具包括扩展残疾状态量表（EDSS）、多发性硬化功能组合、MRI病变活动性、标准化的全脑容量［7，8，13-15］以及残疾的改善［16］。

2.4 临床试验 I/AHSCT是MS中研究最多的干细胞治疗策略。最近一项回顾性分析表明，I/AHSCT治疗达到“没有临床症状”的多发性硬化患者比例（2 年时为 78%～83%）高于现有试验（13%～46%）［12］。I/AHSCT治疗后2年，脑容量损失显著减慢达到接近正常老化的水平［17］。与I/AHSCT相关的死亡率在过去二十年中有所下降［18］。最近研究显示死亡率＜5%［9］，一些试验报告死亡率为零［7］。选择合适的调节强度、患者人群、移植手术、移植时间和移植后护理有助于最大限度地降低移植相关死亡率的风险。

3 MS与间充质干细胞（MSC）

MSC存在于大多数组织中，其旁分泌功能在一些疾病中比传统细胞替代更有治疗作用，在许多组织修复中发挥重要作用。MSC移植的潜在治疗益处具有自限性，需要重复给药。

不同来源的MSC之间可能存在重要差异，这些差异影响组织来源选择。多发性硬化的潜在生物学特点可能影响MSC功能。一些研究发现，从MS患者和非MS患者中分离MSC的培养、分化潜能、表面抗原表达和免疫调节性能差异较大［19-22］，表明自体细胞移植可能不合适。

MSC治疗的最佳剂量仍然是未知的，但目前认可的剂量是每千克体重（1～2）×106个细胞，因此初级MSC不可用于临床，需要广泛使用扩增细胞方案。但是，扩增循环显著减弱了修复和神经保护特性。此外，产量低限制了重复给药。因此，需要探索新的扩增方法。

细胞制剂的类型包括混合单核细胞制剂、纯化的培养扩增MSC、MSC衍生的神经祖细胞。骨髓单核制剂包括许多细胞类型，这种混合制剂在修复脱髓鞘和抑制炎症以及对中风和其他疾病患者有益。一些研究使用混合/非分离细胞；也有使用纯化和培养扩增的MSC［28］。细胞生产中需要保证严格的质量和安全控制，并进行表型和核型的评估、诱变测试和微生物分析。

3.1 输注途径 最佳的输注途径仍然不确定。将细胞直接注射到特定病变中对弥漫性灰质和白质受累益处不大，这是多发性硬化症的特征。静脉输注更安全，大多数MSCs研究采用静脉注射［23］。静脉注射后，许多细胞被困在肺部，但是仍有显著数量进入中枢神经系统，分布广泛，并且可以保持数十年。

3.2 临床试验 目前研究认可MSC治疗MS的可行性和安全性，并且没有异位组织形成。不良反应有：短暂的无菌性脑膜炎常见于鞘内输注；有鞘内注射MSC后急性播散性脑脊髓炎的病例报告；鞘内注射间充质、胚胎和胎儿神经干细胞组合后的胶质增生性脊髓肿瘤；3例年龄相关性黄斑变性患者的玻璃体内注射脂肪组织来源干细胞后严重视力丧失［27］。

MSC治疗最终可能会让位于分子治疗。如果MSC治疗的主要有益效果是旁分泌，那么直接使用冲击细胞中的主要效应物可以达到治疗效果。MSC治疗可降低促炎细胞因子如 IFN-γ［26，31］，TNF-α［30］，IL-1［31］，IL-2［32］，IL-12［33］和 IL-17［26，35，36］的 水平 ，增加抗炎因子 IL-4［28，35］，IL-5［33］和 IL-10［31］的水平。 在一些研究中发现促炎和抗炎细胞因子IL-6的水平增加［27，32］，而一些研究中该细胞因子水平降低［36］。 此外，一些研究表明，MSC的免疫调节特性可部分归因于具有免疫调节功能的分子的表达，如LIF［27］，PDL-1［34］，COX-2［34］，TGF-β1［34］，TSG-6［34］，CD200［34］，HGF［34，35］，IDO-1［29，34］，VEGF［35］，HLA-G［34］，HLA-E［34］和 HO-1［34］。 另一项研究［34］报道神经营养因子如BDNF，CNTF，GDNF，NGF 和 NTF3也由 MSC 表达，证明了这种干细胞在神经退行性疾病中支持旁分泌的潜力。另一项研究［35］证明了MSC通过抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脊髓中的MMP-2和MMP-9活性而起作用。

免疫细胞的增殖和分化显著受到MSC给药的影响。用MSC治疗MS导致B细胞和T细胞［34］的增殖受到抑制，并减少炎症细胞进入中枢神经系统和脊髓［35］。 具体而言，MSC 治疗会抑制 CD4+IFN-γ+Th1［33］和 CD4+IL-17+Th17［31］细胞在中枢神经系统的克隆扩增和侵入。此外，一些研究报道，MSC治疗导致 CD4+IL-4+Th2［33］和 CD4+CD25+FOXP3+Treg［31］细胞克隆扩增的刺激。部分研究发现［27］，给予MSC后，CD44+和CD45RO+记忆T-淋巴细胞的增殖减少，先天免疫系统的细胞也受到MSC治疗影响。MSC处理的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的细胞中，CD11b+Ly6G+中性粒细胞和CD11b+Ly6C+炎症单核细胞的百分比均降低。用MSC处理的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中也检测到CD4+细胞中较低的RORγT和较高的GATA-3转录因子表达水平，这表明MSC处理后，Th17表型受到抑制而Th2亚群受益。Donders等［30］发现用MSC处理的实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠，其树突细胞的分化和成熟，抑制了抗原呈递，并因此启动T细胞免疫。Tafreshi等［34］发现磷酸化 GSK3β的损失可以在用MSC处理的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的神经元中恢复。

MSC治疗后临床条件改善，原因在于干细胞抑制了B细胞、Th1和Th17淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞的增殖和侵入中枢神经系统和脊髓。促炎细胞因子和生长因子IFNγ，IL-2和TGF-β分泌的减少，以及MSC分泌的抗炎因子如GM-CSF，PGE2和IL-6，也可以抑制促炎细胞如中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和CD8+T淋巴细胞的聚集及其向中枢神经系统的侵入。MSC中促炎性细胞因子和生长因子水平的降低以及抗炎因子的分泌也可抑制中枢神经系统中星形胶质细胞的活化，并刺激促炎细胞分化成M2巨噬细胞和具有免疫调节作用的Breg细胞。位于中枢神经系统中的促炎细胞分泌TNF-α，蛋白酶，一氧化氮和髓鞘特异性抗体也受到抑制，减少了少突胶质细胞的死亡和轴突中髓鞘的破坏。最后，通过MSC分泌神经营养因子如 BDNF、CNTF、GDNF、NGF 和 NTF3 也可作用于少突胶质细胞和神经元，进一步抑制疾病的进展。

4 MS与少突胶质细胞祖细胞、多能干细胞（OPC）

少突胶质细胞的主要功能是包绕轴突、形成绝缘的髓鞘结构、协助生物电信号的跳跃式高效传递并维持和保护神经元的正常功能。其异常会导致中枢神经系统脱髓鞘病变和神经元损伤。基于胶质细胞的髓鞘再生策略一直被认为是进行性MS的潜在治疗方法。给髓鞘发育不良的颤抖小鼠脑内注射表达A2B5的胶质祖细胞后，导致髓鞘的广泛形成和临床表型逆转。

4.1 细胞来源、移植处理 OPC主要来源于胎儿组织，由于增殖能力有限，所以能提供细胞的数量有限。诱导的多能干细胞（iPSC）可以作为少突胶质细胞的来源，因此少突胶质细胞具有使用自体细胞的可能［37］。通过CD140a和血小板衍生的生长因子α受体表型选择，可以进一步纯化这些细胞，从而产生更有效的髓鞘碎片。因为是同种异体输注，所以需要对受体进行免疫抑制。免疫抑制剂皮质类固醇、干扰素-β和硫唑嘌呤不会影响OPC的增殖、存活或迁移能力。

4.2 临床试验 OPC不能从血液或脑脊液进入中枢神经系统实质，需要直接注射到中枢神经系统特定位置，其中一些细胞能够在中枢神经系统内迁移相当长距离，因此虽然将细胞注射到限定位置，但仍然能够获得广泛的髓鞘修复。Thiruvalluvan等［37］在动物模型中进行的研究表明，人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的OPC向胼胝体中的MS样病变迁移，并使裸露的轴突髓鞘化；这种新方法表明hiPSC衍生的OPC可用于进展期的MS［37］。通过将iPSC衍生的特异性细胞移植到不同的动物疾病模型中，已经广泛证明了iPSC的治疗潜力。iPSC临床研究需要关注的是安全性和有效性，因为某些来源于iPSC的细胞自体移植后具有引发抗原特异性免疫排斥反应的倾向。目前正在进行一期临床试验，以评估在继发进展型MS患者单一时间点内注射逐步增加剂量的OPC到多个脑内位置的可行性和安全性［38］。

5 展望

现有证据表明I/AHSCT在抑制MS的炎症性疾病活动方面具有实质性和持续的效果。但仍然不确定I/AHSCT治疗复发缓解型MS的确切机制。受益患者应该是相对年轻的，疾病持续时间相对较短的，或者有活跃的复发缓解型MS和累积残疾，但仍然能够活动者。因此病例选择也很重要。

不同组织来源的MSC特性是否相同决定了MSC的选择。需要寻求足够证据证明MSC不会在组织中持续存在以确定MSC移植的治疗益处是自限性的，为重复给药确立依据。如果MSC治疗的主要有益效果是旁分泌，那么MSC治疗最终可能会让位于分子治疗。

缺乏OPC很可能不是MS中髓鞘再造不足的原因，支持和维持髓鞘再生所必需的因子缺乏或者MS病变环境中存在抑制因子，以及退化轴突不能支持髓鞘再生可能是主要障碍。因此，外源性OPC的应用可能无法满足需要，这是未来需要解决的问题。