间充质干细胞的迁移和归巢以及提高其治疗效率的方法

甘凤山，赵娴

( 昆明医科大学附属附属第一医院整形外科，云南 昆明)

0 引言

充质干细胞(MSC)是一种来源于骨髓的非造血细胞。40年前Friedenstein[1]等人首先提出间充质干细胞的概念。2006年，国际细胞治疗协会定义人间充质干细胞的最低标准。它们必须有粘附特性，且能分化成骨细胞，软骨细胞以及脂肪细胞。同时，它们必须能够表达CD105，CD90 和CD7，但对于CD45，CD34，CD14，CD11b，CD79α，CD19 以及HLA-DR 表面分子的表达却是缺失的[2]。人们在临床多个领域尝试应用这些细胞，比如神经内科、心血管内科及骨科，用于修复大块骨缺损。MSC 的归巢属特性和在靶器官的持久性，使其拥有以上诸多用途。目前，造血干细胞移植多通过静脉注射完成。为治疗需要而全身输注细胞意味着需要有高效的迁移和归巢到靶部位的能力。在本篇综述中，我们讨论了关于MSC 归巢的现有知识，特别是着重于骨髓归巢，总结了目前提高MSC归巢效率的方法。

1 MSC 归归巢和迁移到骨髓和其他组织

MSC 迁移和归巢到组织的确切机制尚未完全阐明。一般认为，这些干细胞遵循与白细胞归巢相同的步骤。第一步，这些细胞通过粘附和滚动与内皮细胞接触，导致血液流动速度减慢；第二步，细胞被G 蛋白偶联受体激活，紧接着被整合素介导的激活依赖性阻滞激活；最后，细胞通过内皮细胞和底层基底膜进行迁移。

在动物模型和患者身上已经证明，MSC 具有迁移并归巢到各种组织的能力。早期在动物模型中进行的子宫内膜间充质干细胞移植研究表明，供体来源的非造血细胞存在于骨髓、胸腺、脾脏和肝脏中。Devine 等人的[3]和Chapel 等人的[4]在非人类灵长类动物中进行了MSC 移植，并在多种组织中观察到MSC，在胃肠道中数量最多。MSCs 在不同组织中的百分比为估计介于0.1%和2.7%之间。Erices 等人的[5]描述了人脐带血来源的MSCs 经全身输注后在免疫缺陷(裸)小鼠骨髓中的归巢和存活。几项对患者的研究中也显示MSC 具有归巢能力。

有研究小组使用不同的技术手段分析了系统灌注骨髓间充质干细胞后的迁移动力学。输注后，MSCs 立即聚集在肺内，随后，细胞被从肺中清除并分布到其他组织。这些细胞可通过静脉或动脉内注射进行全身灌注。前者是侵入性最小、操作最简便的方法;然而，相对于静脉，动脉注射因为需要动脉穿刺风险较高，也可能导致微血管闭塞症的发生。

Kyriakou 等人研究了影响MSCs 短期骨髓归巢的因素。静脉注射后24 小时，分别在骨髓、脾脏、肝脏和骨髓中观察到干细胞。并且注意到，放射线对幼龄动物的归巢作用明显增强并随细胞的传代次数的增加而减少[6]。

2 MSC 归巢到骨髓的相关分子

在归巢的过程中不同的分子参与不同的步骤。内皮细胞上的选择素主要参与第一步。特别是对于骨髓归巢，造血细胞E-/ l -选择素配体(HCELL)的表达是非常重要的，HCELL是CD44 在迁移细胞上的一种特殊的糖型。虽然MSCs 表达CD44，但它们不表达HCELL。

参与活化步骤的G 蛋白偶联受体通常是趋化因子受体。已经广泛证明CXCR4-基质衍生因子-1 (SDF-1)轴对骨髓归巢[7]至关重要。

整合素在第三步的稳定激活依赖性阻滞中起重要作用。有研究表明，抑制整合素β1 可以抑制MSC 归巢。整合素形成二聚体，与内皮细胞上的粘附分子结合。整合素α4 和β1相结合，形成迟发性抗原4 (VLA-4)并与血管细胞粘附分子1 (VCAM-1)相互作用。已有研究表明，VCAM-1-VLA4 相互作用在MSC 归巢中起作用。

基质金属蛋白酶(MMP)等溶解酶裂解基底膜的组分是通过内皮细胞层和基底膜进行转运的最后一步。特别是，明胶酶MMP-2 和MMP-9 在这一步中起重要作用，因为它们优先降解胶原和明胶，这是基底膜的两个主要成分。我们发现MSC 的迁移受MMP-2 和组织抑制金属蛋白酶3 (TIMP-3)的调控。MT1-MMP 在MSC 迁移中起作用。基质金属蛋白酶是作为前酶分泌的。ProMMP-2 通过与MT1-MMP 和TIMP-2的相互作用被激活，并被TIMP-1 抑制。这解释了为什么MMP-2、MT1-MMP 或TIMP-2 敲除降低了MSCs 的侵袭能力，以及Ries 等人发现的TIMP-1 敲除导致了的侵袭增加[8]。

除了经典的归巢表达外，不同的研究小组也描述了MSCs上生长因子受体的表达。多项研究表明，生长因子也可诱导间充质干细胞迁移。例如，血小板衍生生长因子(PDGF) AB和BB 可在体外诱导间充质干细胞迁移[9]。另一个参与间充质干细胞迁移的生长因子是肝细胞生长因子(HGF)，它与c-met 结合。PDGF-BB 和HGF 均已作为一种改善MSCs 体外迁移的手段复合于凝胶或支架上[10,11]。

3 如何增加MSC 的归巢效率

MSC 归巢效率与几个因素被认为是有关的。首先，MSCs上的归巢分子表达有限。另一个值得关注的问题是，MSCs 在体外扩增过程中似乎失去了归巢分子的表达。此外，间充质干细胞培养和来自不同组织的间充质干细胞中也存在归巢分子的异质表达，其归巢分子表达谱不同[12]。

由于提高MSCs 在全身给药后的归巢效率和在靶组织中的保留将提高它们的治疗效果，许多研究小组正在研究实现这一目标的方法。主要通过一下策略来实现。

3.1 联合药物输注

体内研究反复表明，经静脉注射后，间充质干细胞被困在肺内。在给小鼠输注骨髓间充质干细胞之前，给小鼠输注血管扩张剂，可以明显减少在肺部截留的间充质干细胞的数量，并显著增加间充质干细胞向长骨骨髓的回流。汤川等[13]将MSCs 移植联合肝素治疗这一策略也显著减少了MSC 在肺部的滞留。

3.2 骨髓间充质干细胞培养前的处理，或改变培养条件

增加膜上CXCR4 的表达是目前研究的重点。实现这一目的的一种方法是在扩增过程中向培养基中添加细胞因子或细胞因子混合物。有研究表明，flt3 配体、干细胞因子(SCF)、IL 3、IL 6 和肝细胞生长因子(HGF)联合作用可增加培养的msc 上细胞内和膜上CXCR4 的表达。预处理后的细胞更多地向SDF-1 梯度迁移，预处理对MSCs 支持造血的功能没有影响。在体内归巢实验中，MSCs 被静脉注射到亚致死照射的小鼠体内，发现细胞因子治疗后骨髓归巢显著增加。其他分子，已经被证明可以增加趋化因子受体CXCR4 表达，比如胰岛素样生长因子1 (IGF - 1)、肿瘤坏死因子α(TNFα)，IL 1β，干扰素γ(IFNγ)[14]。BMS 培养时经糖原合成酶激酶3β(GSK - 3β)抑制剂处理后，可以上调趋化因子受体CXCR4 表达，使其体外迁移能力增强，而不影响细胞的生存能力[15]。经证实，BMS 暴露于补体1q (C1q)，虽然CXCR4 表达没有显著增加，但可增加MSC 向SDF-1 的迁移。

经GSK-3β 抑制剂和C1q 处理后，增加BMS 的MMP 表达，而MMP 在迁移过程中对基底膜的降解至关重要。造血生长因子促红细胞生成素(EPO)和粒细胞的结合集落刺激因子(G-CSF)也被报道可增加MMP-2 在MSCs 中的表达并改善其运动能力[16]。

也有证据表明，短期暴露于丙戊酸诱导的表观遗传调制导致培养的BMS 中CXCR4 和MMP-2 的表达增加，并向SDF-1 的迁移增加。并且对细胞的分化能力没有影响[17]。

另一种正在研究的方法是在缺氧条件下培养MSCs。几组研究表明，这些条件导致CXCR4 表达增加，并改善了MSC在体内和体外的迁移。据报道，趋化因子受体CXCR4 表达的增加是因为缺氧诱导因子(HIF) 1α 增加。缺氧还导致MMPs的差异表达。比如，在缺氧条件下培养的MSCs 中，MMP-2的分泌减少，MT1-MMP 的分泌和活性增加。

对培养条件的一种较简单的改变是保持较低细胞融合度。有的课题组发现培养至完全融合的骨髓间充质干细胞的迁移能力低于维持在低融合状态的骨髓间充质干细胞。与低融合培养的MSCs 相比，高融合培养的细胞分泌更多的MMPs抑制剂TIMP-3，限制了MSCs 的迁移。

3.3 基因改造

由于CXCR4-SDF1 轴对骨髓归巢很重要[18]，许多研究小组设计了转染或转导的实验，在实验中，CXCR4 表达质粒或以非病毒方式或病毒方式进入细胞。在NOD/SCID 移植模型心内注射后，CXCR4 过表达可改善MSC 向骨髓的归巢。在类似的模型中，整联蛋白α4(VLA4 的一个亚基)的过表达与VCAM-1 相互作用，也促进了BMS 向骨髓归巢。然而，这种技术也有一些缺点。最重要的是，人们担心使用病毒载体引入质粒DNA 会带来插入性肿瘤形成的风险。

不同的质粒DNA 非病毒转染模式已经被开发出来。有究小组使用mRNA 核转染的方法使MSC 中的CXCR4 过表达。他们获得了表面受体90%的表达，但细胞存活率仅为62%，未观察到间充质干细胞归巢的增加[19]。另一组研究了利用超声和微泡在msc 中插入短干扰RNA 以提高存活率的可行性。可以获得显著的靶基因敲除(PTEN)，但操作后细胞受到损伤。

3.4 细胞表面工程

近年来引起人们兴趣的一种提高MSCs 归巢效率的方法是细胞表面工程，即细胞表面的时的修饰。已有研究表明，这些修饰不影响细胞的活力、增殖、粘附或分化[20-22]。

2008 年，Sackstein 等人发表了一篇关于这一领域的开创性论文，他们报告说，他们已经将在MSC 上表达的天然CD44在体内转化为造血细胞E-选择素/ L-选择素配体(HCELL)的糖苷形式。E -选择素在造血干细胞(HSC)向骨髓定向过程中起关键作用，然而，MSC 不表达HSC 骨髓归巢所需的两种E -选择素配体P -选择素糖蛋白配体-1 (PSGL-1)或HCELL，从而削弱了它们对骨髓的归巢能力[23]。MSC 本身表达CD44。Sackstein 等人能够将CD44 转化为HCELL 糖体。这种处理对细胞的活力和表型没有影响。在NOD/SCID小鼠尾静脉注射间充质干细胞的体内归巢实验表明，即使在CXCR4 缺失的情况下，HCELL+间充质干细胞仍归巢至骨髓。

Sialyl Lewis X (SLE X)是PSGL-1 的活性位点。因此，将这种分子引入间充质干细胞膜中也可以改善间充质干细胞的归巢。Sarkar 等[24]使用生物素化微囊泡修饰MSCs。当囊泡与间充质干细胞接触时，它们融合到细胞膜中，从而产生生物素化的间充质干细胞。利用链霉亲和素连接剂，生物素化的SLE X 可以固定在细胞表面。体外实验表明，对照组的MSCs相比，表达SLE X 的MSCs 在剪切应力作用下表现出更好的黏附性。

Lo 等人[25]描述了另一种工程方法来改善MSC 与选择素的结合并促进吸附和转移。将PSGL-1 (Fc19)的前19 个氨基酸与IgG 尾巴和SLEX 糖链结合，形成泛选择结合配体。这些MSC 在剪切应力作用下确实具有粘附能力。

3.5 目标组织的修饰

最后，MSC 的迁移和归巢可以通过修饰靶组织来影响。在早期的归巢研究中，已经证明了通过辐射改变目标组织来增加MSC 归巢。化疗和放疗后，骨髓中SDF-1 水平升高，对造血干细胞和间充质干细胞的吸引力增强。

4 结论

间充质干细胞可用于多种治疗，具有不可替代的优势。问题在于其归巢效率低，达不到理想的治疗效果。现有研究表明间充质干细胞几乎不表达或很少表达归巢相关受体，因此限制了其迁移能力，从而减少了其归巢效率及治疗效果。而造成这种分子的低水平表达的原因和MSCs 在培养、扩增过程中培养方式和方法的不同导致了这种归巢相关因子的丢失有关。本文总结了改进MSC 归巢的策略和方法。这些方法都表现出有利于MSC 归巢到目标组织，但是其中有许多尚未在体内得到验证。在将这些技术应用于临床之前，应该首先在体内归巢模型中对这些技术进行验证。目前MSC 的分离和扩增方法存在很大的差异。分离和扩增方法的不同可能对MSC 功能、迁移和归巢产生重大影响，未来应建立标准化的MSC 分离和扩增方法，这也将更容易评估MSCs 在临床环境中的治疗效果。另外，间充质干细胞归巢的机制尚未完全阐明，仍有大量研究针对其进行。更好的理解间充质干细胞归巢机制以及影响这一过程的因素，将使研究人员能够优化这些干细胞的迁移能力及其在靶组织中的治疗效果，也将有利于其更好的应用于临床，对间充质干细胞发挥更大的治疗作用具有重要意义。