徕卡免疫组化平台在非小细胞肺癌间变性淋巴瘤激酶检测中的价值

丘佳明，顾玉兰，蒋廷旺，魏 炜，林小星，陈志军

(常熟市第二人民医院 1.病理科；2.肿瘤科；3.科技处；4.呼吸内科，江苏 常熟215500)

肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率均位列所有恶性肿瘤的第一位[1]。肺癌总数的80%-85%是非小细胞肺癌(NSCLC)，间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性NSCLC是肺癌的一种重要分子亚型，占全部NSCLC的3%-7%[2]。近几年针对于ALK阳性NSCLC的诊疗研究取得了较大突破，克唑替尼(Crizotinib)、阿来替尼(Alectinib)、塞瑞替尼(Ceritinib)等ALK酪氨酸激酶抑制剂研发成功，可明显提高ALK阳性NSCLC患者的客观缓解率，延长生存期。因此，精准检测ALK基因状态，对筛选ALK酪氨酸激酶抑制剂的适用患者有决定性的临床意义。

目前，国家药品监督管理局(CFDA)已经批准4个检测方法可以应用于ALK检测，包括检测ALK融合蛋白的免疫组织化学(IHC)；检测DNA水平上ALK基因易位的荧光原位杂交(FISH)；检测ALK融合mRNA的即时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)；检测ALK易位DNA序列或融合mRNA序列的二代测序(NGS)。其中FISH被认为是ALK阳性NSCLC诊断的金标准[3]，RT-PCR和NGS也均具有较高的灵敏性、特异性和符合率，但是这3项检测对样本、技术水平和实验室要求较高，收费昂贵且试剂成本高，大部分中小型病理实验室尚未开展。IHC操作简单、收费较低，结果判读相对简单，适合中小型病理实验室开展。IHC方法检测ALK与检测其它抗体不同，不同的平台和不同的抗体克隆会有不同的检测效果。专家共识[4]强烈推荐由Roche Bench Mark XT/Ultra自动免疫组化染色机和Roche Ventana生产的克隆号D5F3的ALK抗体所搭建的平台(简称Roche-IHC平台)。对于其余的IHC平台，专家共识意见是仅进行初筛。本实验选用我院2019年购入并且国内外较多实验室使用的Leica BOND MAX IHC自动免疫组化染色机和Leica Novocastra生产的克隆号5A4的ALK抗体组成Leica-IHC平台，进行NSCLC的ALK检测，并与FISH方法检测结果进行比较，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集常熟市第二人民医院2018年1月至2019年12月肺癌手术切除、穿刺活检和纤支镜活检标本，根据2015版WHO肺肿瘤分类[5]，经两位高年资病理医师复阅切片，确诊为原发且肿瘤细胞数多于100个的NSCLC共197例，包括浸润性腺癌140例和鳞癌57例。所有标本在离体后即浸于3.7%中性缓冲甲醛溶液，溶液体积10倍于标本体积，固定时间为6-12 h，规范取材，常规脱水，石蜡包埋，4 μm切片。

1.2 IHC检测及判读标准检测仪器为Leica BOND MAX自动免疫组化染色机。一抗试剂为Leica Novocastra ALK单克隆抗体(克隆号5A4)。二抗试剂使用仪器封闭配套试剂，为Leica Bond Polymer Refine Detection Kit试剂套装。操作流程按照抗体试剂盒说明书进行。每批检测设置阳性对照和阴性对照。结果判读参照《常规免疫组织化学初筛ALK阳性非小细胞肺癌专家共识》[6]和抗体说明书,具体如下：0(阴性)：所有肿瘤细胞均无明显着色；1+：>5%的肿瘤细胞呈现模糊、微弱的细胞质着色，或≤5%的肿瘤细胞呈现任何程度的细胞质着色；2+：>5%的肿瘤细胞呈现中等程度的细胞质着色；3+：>5%的肿瘤细胞呈现较强程度的细胞质着色。

1.3 FISH检测及判读标准使用CFDA批准的雅培ALK基因重组检测试剂盒(Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit)，原位杂交仪为Leica Thermo Brite，荧光显微镜为Leica DM2000。操作流程按照试剂盒说明书进行。检测结果的判定标准为[7]：ALK融合基因无表达的肿瘤细胞将会出现橘红色和绿色信号重叠融合为黄色，或者相互粘合，即间隔小于两个信号的直径；ALK融合基因表达的肿瘤细胞会出现橘红色和绿色信号相互分离，即两个信号之间的间距≥2个信号直径；如果肿瘤细胞出现一个融合的黄色信号和一个单独的橘红色信号，也属于ALK融合基因表达。以此标准，选取100个肿瘤细胞，其中至少有15%出现表达，可判读为阳性，反之则为阴性。

2 结果

Leica-IHC共有25例阳性，阳性率为12.7%(25/197)(图1)；FISH共有20例阳性，阳性率为10.2%(20/197)(图2)。Leica-IHC检测的25例阳性病例中，1+为5例(FISH阳性1例)，2+为3例(FISH阳性2例)，3+为17例(FISH阳性17例)。Leica-IHC检测为阴性的病例用FISH方法检测也均为阴性。Leica-IHC的敏感度为100%，特异度为97.2%，阳性预测值为80%，阴性预测值为100%。对于Leica-IHC检测为3+病例，敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均为100%。

图2a FISH检测ALK在NSCLC的表达(阳性) 图2b FISH检测ALK在NSCLC的表达(阴性)

3 讨论

精准医学时代的到来，对检测精准性的要求越来越高，靶向治疗成功的前提是通过可靠的检测方法筛选出目标人群。对于NSCLC患者来说，准确地检测ALK是靶向治疗的前提。

NSCLC中ALK基因变异主要是ALK基因断裂后与其它基因进行了重排融合，其中棘皮动物微管相关类蛋白4(EML4)基因与ALK形成的融合亚型最为常见。ALK的酪氨酸激酶区域的外显子和EML4的N末端卷曲螺旋区域的外显子相互结合，形成稳定的二聚体，然后通过自身磷酸化，激活下游PI3K/AKT、RAS/MAPK、JAK/STAT3等通路，引起细胞异常分化增殖，促进NSCLC的发生和发展[2]。目前已经发现了20多种EML4-ALK融合亚型，其中最常见的亚型有两个，一个是E13;A20亚型(EML4外显子13与ALK外显子20融合)，另一个是E6a/b;A20亚型(EML4外显子6a/b与ALK的外显子20融合)，这两种约占全部亚型的60%[8]。根据以上的生物学基础，ALK酪氨酸激酶抑制剂的研发和临床应用在近年来取得了较多成果，明显提高了EML4-ALK融合基因阳性NSCLC患者的客观缓解率，并且延长了无进展生存时间。本实验所检测的ALK，即指FISH方法检测的EML4-ALK融合基因和IHC方法检测的ALK融合蛋白。除了最常见的ALK与EML4融合外，还已经发现了ALK与其它多个基因的融合变异，包括TFG、KLC1、SOCS5、KIF5B、TPR、H1P1、BIRC6等，这些少见复杂的融合变异类型的临床意义还需进一步研究[9]。

自1988年第一台免疫组化仪问世，国内外已经推出了几十种仪器应用于临床，主要有罗氏(Roche)、徕卡(Leica)和丹科(Dako)这3个品牌[10,11]，共占据约65%以上的市场份额。本文实验使用的Leica Bond Max，相比其它两个品牌，优势是Covertiles专利技术，独特的“湿盒”微环境，侧面滴加试剂，试剂消耗量最小，还可以最大限度减少组织损伤，同时掉片率也最低，缺点是有标本污染可能。相比FISH检测，IHC已经有了更规范的标准化流程，更好的技术稳定性，更短的检测时间，更便宜的试剂，而且对于标本没有细胞数的限制，本实验全部197例标本均获得了实验数据。本文实验严格按照试剂盒和仪器操作流程,切片整体着色较为鲜艳、核质对比明显、组织和细胞结构清晰、背景干净无杂质，检测ALK的效果满意，可以满足日常临床需要。

IHC平台检测效果如何，除了仪器的质量之外，试剂的质量至关重要。目前国内外生产的ALK抗体主要有D5F3、5A4、ALK1、1A4、SP8这五种克隆[12,13]，其中1A4的特异性偏低(70%)，ALK1的敏感性偏低(67%)，SP8更适用于检测间变性大细胞淋巴瘤，均不推荐常规使用于NSCLC。关于5A4和D5F3这两个抗体的应用，Savic等[14]通过对303例NSCLC检测，认为5A4和D5F3同样适用于NSCLC的ALK检测，Roche Bench Mark和Leica BOND MAX都可用5A4进行检测。Marchetti等[15]比较了意大利1031例肺腺癌的两个IHC平台检测方法，并以FISH为参照，Roche-IHC检测灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值与Leica-IHC检测均近似。Fiset等[16]回顾加拿大5958例肺癌的ALK检测结果及使用ALK酪氨酸激酶抑制剂的生存期，认为5A4可作为ALK重排肺癌的一种强有力的诊断方法，并与治疗反应和生存率相关。Savic等[17]在另外一项关于细胞免疫的研究中，使用Leica-IHC与FISH比较，敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为93.3%、96.0%、93.3%和96%,5A4克隆免疫细胞化学的具有高准确性。本文实验结果与以上国外报道近似，使用本院新引进的Leica-IHC平台，以FISH检测结果为参照，Leica-IHC的敏感度为100%，特异度为97.3%，阳性预测值为80%，阴性预测值为100%。对于Leica-IHC检测为3+病例，敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均为100%。本文实验结果可以提示：Leica-IHC检测为3+病例可判读为阳性，对于2+和1+病例需FISH方法进行验证。

综上所述，Leica-IHC检测ALK方法可行，应用Leica-IHC平台进行NSCLC患者ALK初筛是有价值的。