汉族人群ADIPOR1 rs7539542与冠状动脉粥样硬化性心脏病和2型糖尿病的关联分析

李 响 蒲连美 阮 杨 李 红 金泽宁*

(1.首都医科大学附属北京安贞医院急诊危重症中心，北京 100029；2.首都医科大学附属北京天坛医院心内科，北京 100070)

脂联素(adiponectin，APN)是一种主要由脂肪细胞分泌的脂肪因子，具有抗感染、胰岛素增敏、抗动脉粥样硬化及抗凋亡等特性，在调节能量代谢方面发挥重要作用[1]。脂联素受体1(adiponectin receptor 1,ADIPOR1)是介导APN 生物学效应的主要受体之一[2]。ADIPOR1基因过表达可增强APN的生物学效应[3]，而敲除ADIPOR1基因或下调其表达活性，可增加胰岛素抵抗和糖异生[4]、增加泡沫细胞的形成，进而加速心血管疾病的进展[5]。基于共同土壤假说[6]，既往研究[7-8]显示ADIPOR1基因多态性与冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary artery disease，CAD)和2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)等代谢性疾病的易感性相关。然而，具有如此多效性关联的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点均位于ADIPOR1基因的内含子区，目前鲜有阳性SNPs在ADIPOR1基因非内含子区的报道。因此，本研究旨在测序ADIPOR1基因外显子、5′和3′非翻译区(untranslated regions,UTR)区域，分析ADIPOR1基因非内含子区的SNPs是否与CAD和/或T2D的易感性相关。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2015年1月至2017年11月于首都医科大学附属北京安贞医院心血管相关内科病房住院并行冠状动脉造影检查的患者1 000例。所有研究对象均为无血缘关系的北方地区的汉族常住居民,签署知情同意书并同意提供外周血用于检测。此项研究得到首都医科大学附属北京安贞医院伦理审核委员会的认可。符合世界医学会赫尔辛基宣言：人体医学研究的理论原则。

CAD入选标准(CAD组)：有较为典型的心绞痛症状且经冠状动脉造影证实3支主要血管(前降支、回旋支、右冠状动脉)至少有1支管腔狭窄≥75%。T2D入选标准(T2D组)：≥35岁之后临床诊断患T2D，需药物控制血糖(口服降糖药和/或皮下注射胰岛素)>1年且目前仍需使用降糖药。CAD合并T2D入选标准(CAD+T2D组)：同时符合CAD和T2D的入选标准。对照组入选标准参照既往研究[9]：冠状动脉造影提示任意血管管腔狭窄<40%，无CAD和/或T2D的病史和客观证据，无CAD和/或T2D的一级直系亲属，无血糖、糖化血红蛋白、心肌坏死标志物、心电图及超声心动图异常。

排除标准：①年龄<35岁；②1型糖尿病，糖尿病酮症酸中毒，高渗性非酮症糖尿病昏迷，相关的自体抗体阳性；③冠状动脉造影提示存在心肌桥、冠状动脉痉挛或扩张，严重心力衰竭(心功能Ⅲ～Ⅳ级)、心肌病或先天性心脏病；④继发性高血压、原发性肾脏疾病；⑤自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮)、癌症、感染性疾病、严重的心脏瓣膜病，严重的肝和/或肾功能异常、怀孕或围产期、目前使用特殊药物(如糖皮质激素或免疫抑制剂)。

1.2 研究方法

临床数据的收集：所有的研究对象在22时禁食后，于次日早晨进行人体测量，并采集血液样本进行相关临床检测和DNA提取。对研究对象进行问卷调查，获得高血压、高脂血症和脑梗死病史、用药史、吸烟或饮酒习惯(回答“完全没有”的被分为从不吸烟或饮酒)及家族史等。根据欧洲心脏病学会和欧洲高血压学会高血压指南[10]，由训练有素的观察员测量血压。体质量指数(body mass index,BMI)是根据个人的身高和体质量(kg/m2)计算出来的。采用超声心动图和腹部超声对相关脏器的功能和结构进行评估。

SNPs的选择及其分型：取EDTA抗凝的外周血0.5 mL，采用全血DNA试剂盒(北京天一辉远生命科技有限公司)提取基因组DNA。采用260 nm/280 nm吸光度法测定提取的DNA质量。采用Sanger测序法3730-XL基因分析仪(美国Applied Biosystems)测定SNPs的基因型。

首先对100例CAD合并T2D的DNA样本进行测序。所选择的测序区域包括ADIPOR1基因所有外显子、5′和3′侧翼区域上下各1 000 bp。然后，筛选次要等位基因频率>0.05同时P值<0.3的SNPs(与国际人类基因组单体型图计划提供的北京汉族人群相关SNPs的等位基因进行比较，http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)。最终入选以下3个SNPs进行基因分型：rs10581 C>T(位于3′UTR)，rs7539542 G>C(位于3′UTR)及rs7517286 T>C(位于5′UTR)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 基线资料

通过重新核对出院时的临床资料以及对各组间的性别、年龄及BMI进行匹配，1 000例样本中共有737个符合条件并进行了基因分型。最终入选对照组193例，T2D组142例，CAD组203例，CAD+T2D组199例。4组研究对象的临床及实验室资料详见表1。组间比较的结果详见表2。与对照组相比，CAD组、T2D组及CAD+T2D组有较高比例的高血压患者(67.1%、67.6%,70.4%vs39.9%,P<0.001)和较低水平的高密度脂蛋白胆固醇(0.96、1.02、0.96 mmol/Lvs1.13 mmol/L,P<0.001)。

表1 4组间临床基线资料比较Tab.1 Comparison of clinical and demographic characteristics

表2 各组间临床资料的多重比较Tab.2 Multiple comparison of clinical and demographic characteristics

2.2 SNPs关联分析

对照组的基因型频率均符合HWE(PHWE>0.05),详见表3。测序图详见图1。rs7539542等位基因和基因型频率在4组间的差异具有统计学意义(P=9.62×10-6和P=3.94×10-4)，详见表3。通过显性、隐性及加性遗传模型分析，rs7539542 C与CAD(OR=1.67～2.34,P=2.87×10-4～0.002)和CAD合并T2D(OR=1.52～2.08,P=0.003～0.016)的易感性相关，与T2D的易感性无明显关联(P>0.05),详见表4。进一步对疾病状态进行分层分析(表5)，发现rs7539542 C增加T2D患者CAD的易感风险(OR=1.58～2.9,P=0.002～0.038)。rs7517286和rs10581的等位基因间存在连锁不平衡(图2)，两者的等位基因和基因型频率在4组间的差异均无统计学意义(P>0.05，表3)。

图2 ADIPOR1基因3个SNPs在对照组中的连锁不平衡分析图Fig.2 Linkage disequilibrium plots of 3 SNPs in ADIPOR1 gene in control group SNPs:single nucleotide polymorphisms.

表3 ADIPOR1基因3个SNPs的等位基因和基因型的分布Tab.3 Allelic and genotypic frequencies of 3 SNPs in ADIPOR1 n(%)

如表1所示,3个病例组中高血压的患病率明显高于对照组(66.5%vs39.9%,χ2=42.001,P=9.12×10-11)。考虑到高血压是心血管疾病的影响因素，于是对是否患高血压进行分层分析。结果显示在非高血压亚组，rs7539542 C与CAD(OR=2.03～3,P=0.001～0.008)和CAD合并T2D(OR=1.92～3.3,P=0.004～0.025)的易感性相关，详见表4,并增加T2D患者CAD的易感风险(隐性模型：P=0.018,OR=4.46；加性模型：P=0.038,OR=1.82)，详见表5。

表4 ADIPOR1基因rs7539542位点与CAD、T2D及CAD合并T2D的关联分析Tab.4 Association of rs7539542 in ADIPOR1 with T2D,CAD and T2D with CAD

表5 ADIPOR1基因rs7539542位点与疾病状态的关联分析Tab.5 Association of rs7539542 in ADIPOR1 with diseases stratified by CAD or T2D status

rs7539542基因型与高血压交互作用的P值范围为0.14～0.86(表6)，提示rs7539542基因型与高血压无显著的交互作用。对照组进行高血压的分层分析，也未发现阳性结果(P值范围为 0.157～0.263)。

表6 ADIPOR1基因rs7539542位点基因型和高血压的交互作用Tab.6 rs7539542 genotype-hypertension interaction

2.3 基因与环境的交互作用

采用Logistic回归分析方法对非高血压亚组进行基因-环境的交互作用分析。结果显示，与rs7539542 CG+GG携带者相比，rs7539542 CC携带者与三酰甘油(triglycerides，TG)存在交互作用，并增加CAD (P=0.041,OR=5.006,95%CI=1.066～23.51)和CAD合并T2D的易感风险(P=0.04,OR=5.381,95%CI=1.081～26.786)。

3 讨论

本研究结果提示在中国北方汉族人群中，rs7539542不仅与CAD和CAD合并T2D的易感性有关，还增加T2D患者的CAD易感风险。这一发现与本课题组既往研究[9]结果相一致,rs7539542与中国北方汉族人群的CAD易感性有关。Soccio等[11]对高加索人群的研究提示,rs7539542增加T2D患者的CAD易感风险。然而，本研究不能复制rs7539542与T2D的易感关联。Qi等[12]的研究显示,rs7539542(也称为rs1139646)与女性白种人的T2D易感性有关。但本研究对样本进行性别分层分析后并未发现上述关联(结果未列出)。这一阴性关联与既往在高加索人[13-15]、东亚人(如日本[16]和韩国[17])和非洲[13]人群中的研究结果一致。目前无明确证据提示rs7539542和T2D的易感风险间存在关联性。也就是说，rs7539542与CAD的易感性关联可能独立于T2D。

考虑到3个病例组样本中高血压的患病率较高，故对血压进行分层分析，结果表明与总体样本一致的结论仅出现在非高血压亚组。因高血压被认为是CAD主要的传统危险因素之一，不除外与rs7539542存在交互作用。故在各病例组间对rs7539542基因型与血压的交互作用进行检测，还在对照组中对血压进行分层分析，结果未发现rs7539542与血压之间有显著的交互作用。这提示rs7539542与CAD的易感性关联可能独立于血压的影响。

环境因素在慢性代谢性疾病的发生发展中起着重要的作用，并可能影响基因对疾病的表型。因此，在非高血压病例组中，进一步分析了基因与环境因素的交互作用。结果显示，rs7539542 CC基因型与TG存在交互作用，增加CAD、CAD合并T2D的易感风险(OR分别为5.006和5.381)。可以看出，与rs7539542单独分析相比，rs7539542联合TG后明显增加CAD和CAD合并T2D的相对风险(即OR值)。在高脂血症中，除低密度脂蛋白胆固醇外，高浓度的TG也被认为是CAD的危险因素[18]。血浆低浓度的脂联素[1]和ADIPOR1多态性[18]与高浓度的TG相关。因此是否对rs7539542风险基因携带者进行早期血脂筛查并强化降脂治疗有待进一步研究。

本研究存在一些局限性。一方面缺乏功能学研究，例如检测rs7539542 microRNA，进一步检验rs7539542是否是影响CAD遗传基础的功能变异位点。尤其是既往研究[11]显示,rs7539542影响ADIPOR1基因的表达。另一方面，本研究样本量不足可能降低了检验效能，尤其在亚组或分层分析中。但本研究具有严格的入排标准，并通过入选极端表型来增强检测等位基因差异的能力。如CAD组入选标准为具有较为典型的心绞痛症状且冠状动脉造影证实为主要血管至少有1支管腔狭窄≥75%，并非传统意义的以管腔狭窄≥50%为入选标准，同时除外了心肌桥、冠状动脉痉挛及严重扩张等非动脉粥样硬化造成管腔狭窄的情况；再如T2D入选标准为需药物控制血糖>1年且目前仍需使用降糖药，除外轻型(如通过运动和饮食即可控制血糖)、一过性、药物源性或相关抗体阳性的血糖增高患者。此外，本研究在各组间对一些如性别、年龄及BMI等CAD和T2D的传统危险因素进行了匹配，尽可能降低了混杂因素对结果的影响。考虑到CAD和T2D均为慢性复杂性疾病，受多基因和环境因素的相互影响，故ADIPOR1基因单多态位点在CAD和T2D发生发展中的作用及其临床应用价值尚需进一步研究。

综上所述，通过多病例-对照的研究方法，本研究发现了位于ADIPOR1基因非内含子区域的rs7539542多态位点不仅与CAD和CAD合并T2D的易感性相关，还增加T2D患者CAD的易感风险，尤其是在非高血压患者中。此外，rs7539542与TG存在交互作用，进一步提高了CAD和CAD合并T2D的易感风险。本研究结果有助于进一步研究ADIPOR1基因在CAD发生发展中的作用。