富血小板血浆对兔骨关节炎软骨中基质金属蛋白酶-13表达的影响

王振中 喻 飞 杨 波 马立峰*

(1.北京积水潭医院骨科，北京 100035;2.首都医科大学附属北京友谊医院骨科，北京 100050)

骨性关节炎作为一种退行性关节疾病，特征为关节软骨的磨损、变薄甚至缺损，软骨下骨的硬化，骨赘形成以及滑膜组织的炎症性改变等；最终导致疼痛和关节功能异常[1-2]。然而该疾病的病理过程尚未完全阐明，众多研究[2-5]表明，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的过度表达，尤其是MMP-13的表达在骨性关节炎的发生发展过程中起到重要作用。富血小板血浆(platelet-rich plasm，PRP)，是富含血小板的全血提取物，血小板经过脱颗粒作用能够释放多种生长因子，包括转化生长因子β、血小板源生长因子等。实验[6-10]证明这些因子可抑制炎症过程，促进软骨基质的合成而发挥软骨保护作用。然而其对MMP-13的作用目前无相关报道，本实验旨在探讨PRP通过抑制MMP-13表达而发挥软骨保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30只成年纯种新西兰雄性大白兔，体质量1 800～2 000，平均(1 900±200)，由首都医科大学附属北京友谊医院实验动物中心提供[实验动物许可证号：SYXK(京)2018-0003]，采用数字表法随机分为对照组、关节炎组、PRP组。其中,关节炎组和PRP组给予10%(质量分数)水合氯醛3 mL腹腔麻醉，常规备皮、消毒、铺无菌单，取左后肢膝关节内侧切口3 cm，切开皮肤皮下关节囊，切除内侧半月板，切断前后交叉韧带，保护关节软骨，用庆大霉素0.9%(质量分数)氯化钠注射液冲洗关节腔，妥善止血后逐层关闭切口，伤口妥善包扎。对照组仅切开关节囊，用庆大霉素0.9%(质量分数)氯化钠注射液冲洗伤口后关闭伤口。术后饲养于清洁级环境下，并定期给予伤口换药处理[11]。于术后第一周，将冻存的PRP于恒温箱中解冻后，给予PRP组关节腔内注射PRP 0.2 mL，其他两组给予等量注射0.9%(质量分数)氯化钠注射液。术后第五周，空气栓塞法处死各组兔，获取左膝关节。

1.2 PRP的制备

术前于兔右耳缘中部暴露耳缘静脉，以乙醇消毒后抽取5 mL静脉血，置于枸橼酸钠抗凝管中，按照Aghaloo两步离心沉淀法[8]制备0.2 mL PRP，置于-80 ℃冰箱中备用。

1.3 软骨厚度测量

切取各组兔膝关节内侧股骨髁负重区全层软骨切片3 mm，经过10%(体积分数)甲醛固定，脱水，脱钙，石蜡固定，HE染色，显微镜下测量软骨厚度，并计算各组平均值。

1.4 免疫组织化学染色

用MMP-13单抗(1∶50，美国圣克鲁兹生物技术公司)和生物素标记的山羊抗兔二抗(1∶100，美国圣克鲁兹生物技术公司)分别孵育固定后的内侧股骨髁负重区软骨切片，显影剂显影后于镜下计数MMP-13阳性细胞数。

1.5 免疫荧光定量MMP-13

软骨切去剩余股骨内侧髁软骨层，用胶原酶分解软骨，离心分解液获取软骨细胞，每组等分为两份。将细胞以1×105个/孔接种于6孔板，经包膜穿孔，用MMP-13单抗(1∶50，美国圣克鲁兹生物技术公司)孵育，染色剂染色，于荧光显微镜下观察，通过Image-pro Plus 6.0软件分析荧光强度。

1.6 Western blotting法检测MMP-13表达量

将获得的各组软骨细胞裂解，提取MMP-13蛋白，以β-actin为内参，检测各组MMP-13 蛋白表达量。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组关节软骨形态和厚度变化

各组兔膝关节软骨HE染色显示对照组关节软骨表面平滑，关节软骨各层结构完好，厚度基本正常；关节炎组软骨表面毛糙，软骨内结构紊乱，软骨厚度丢失明显；PRP干预后，软骨厚度得以保留，软骨结构也有明显改善，详见图1。3组间软骨厚度比较差异有统计学意义(P<0.05)，关节炎组明显低于对照组和PRP干预组，详见表1。

图1 各组兔膝关节软骨厚度Fig.1 Cartilage thickness in every groupA:HE staining(100×);B:statistics data;a:control group;b:osteorathritic group;c:platelet-rich plasm group;*P<0.05 vs control group and platelet-rich group.

表1 各组软骨厚度Tab.1 Cartilage thickness

2.2 软骨内MMP-13阳性细胞数

免疫组织化学染色结果详见图2。3组间软骨内MMP-13阳性细胞数比较差异有统计学意义(P<0.05),其中关节炎组关节软骨内MMP-13阳性细胞数量明显高于对照组,PRP干预后MMP-13阳性细胞数明显降低(P<0.05),详见表2。

表2 软骨内MMP-13阳性细胞数Tab.2 Number of MMP-13 positive cells

2.3 MMP-13蛋白免疫荧光定量

免疫荧光显像结果详见图3。3组间软骨内MMP-13表达量比较差异有统计学意义(P<0.05)，关节炎组MMP-13表达量高于对照组，PRP干预后MMP-13的表达量明显降低,组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05),详见表3。

表3 各组兔膝关节软骨细胞MMP-13蛋白荧光显像结果Tab.3 Immunohistochemical staining result

图3 各组兔膝关节软骨细胞MMP-13蛋白荧光显像Fig.3 Immunohistochemical staining resultA:immunohistochemical staining(200×);B:statistics data;a:control group;b:osteorathritic group;c:platelet-rich plasm group;*P<0.05 vs control group and platelet-rich group;MMP-13：matrix metalloproteinase-13;The red color represented MMP-13 protein.

2.4 MMP-13蛋白表达情况

Western blotting结果(图4)显示，关节炎组随着关节炎性反应的出现，MMP-13的表达增多；而PRP的干预能够明显降低MMP-13的合成表达,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 各组兔膝关节软骨细胞MMP-13蛋白表达量Fig.4 Expression of MMP-13 in each groupA:Western blotting;B:statistic data;a:control group;b:osteorathritic group;c:platelet-rich plasm group;*P<0.05 vs control group and platelet-rich group;MMP-13:matrix metalloproteinase-13.

3 讨论

骨性关节炎的特征性病理过程是Ⅱ型胶原的非生理性降解导致关节软骨的破坏，由于关节软骨自我修复潜能很低，决定了骨性关节炎病理过程的不可逆性[1,3]。有研究[2,12]显示，基质金属蛋白酶的过度表达是骨性关节炎病理过程的中心环节。基质金属蛋白酶家族中MMP-13被认为是降解胶原最重要的酶之一，它对Ⅱ型胶原的降解作用是其他MMP的5～10倍[2,13-14]。同时有研究[4,15]显示，MMP-13定位于关节软骨的较深层,该观点与本实验的结果相符，免疫荧光染色提示MMP-13阳性细胞多定位于关节软骨的中层。因此，延缓骨性关节炎的发生发展，可将抑制MMP-13的过度表达做为治疗靶点。

目前对于骨性关节炎的治疗，无论是非甾体药物还是手术都有一定程度的局限性，而理想的治疗方法是有效而不良反应小。PRP作为全血提取物，已经应用于临床多种组织修复中，包括促进肌腱愈合，加速骨修复等[16-18]。PRP活化后可释放一系列生长因子，包括血小板源性生长因子，转化生长因子β，Ⅰ型胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子等，这些因子广泛参与到各种组织的修复[16,19-22]；同时，PRP释放的纤维原等可作为支架，支持组织的修复。也有很多临床研究[7,23]显示，PRP具有促进软骨修复，减轻关节疼痛的作用，但其具体作用机制不详。基于此笔者提出假设PRP是否具有抑制MMP-13表达的作用，并通过动物实验加以证明。

本实验选取兔膝关节骨性关节炎模型，该模型广泛应用于骨性关节炎试验中，建模成功率高[11]。实验结束时，关节炎组兔左后肢膝关节软骨磨损明显，并有不同程度的软骨下骨硬化和滑膜炎表现，大体符合骨性关节炎的表现。通过动物实验可以观察到，PRP关节腔注射减轻了骨性关节炎的表现，PRP组兔的关节软骨厚度得到了保留，同时表面的磨损也明显减轻。更重要的是，PRP可减少MMP-13阳性细胞的表达，同时抑制MMP-13蛋白的表达。

本实验证明，PRP是通过抑制MMP-13的表达，从而发挥软骨保护作用的。实际上，本研究尚需要进一步完善，包括：①明确PRP释放的因子中哪些具有软骨保护作用；②各种因子软骨保护作用的具体机制。相信随着研究的不断深入，PRP软骨保护作用机制将被进一步阐明，为更好治疗骨性关节炎提供客观实验依据。