基于Notch/STAT信号通路研究PCG对哮喘EOS的调控作用及分子机制

任宇哲 于宙 陈宏 杨泽一 杨祥正

[摘要] 目的 探討PCG治疗哮喘的作用靶点及分子作用机制。 方法 将80只Wistar大鼠随机分为Control组、Model组、平喘颗粒（PCG）组及地塞米松（DXMS）组，每组20只。联合吸入卵白蛋白和氢氧化铝制备哮喘模型大鼠，造模结束前5 d开始灌胃给予相应的药物干预治疗，每组根据成模情况取10只用于后续实验。比较四组支气管肺泡灌洗液（BALF）及血清嗜酸性粒细胞（EOS）计数，EOS阳离子蛋白（ECP）和活化趋化因子（Eotaxin）的表达;采用RT-PCR和Western blot检测肺Notch、STAT信号通路相关蛋白及mRNA的表达。 结果 Model组BALF及血清EOS计数高于Control组（均P < 0.01）;PCG组BALF及血清EOS计数低于Model组（均P < 0.01）。Model组ECP及Eotaxin含量高于Control组（均P < 0.01）;PCG组ECP及Eotaxin含量低于Model组（P < 0.05或P < 0.01）。Model组Notch1、2、4，Hes，Jagged1，Delta4蛋白及mRNA表达高于Control组;Notch3，Delta1、3蛋白及mRNA表达低于Control组（均P < 0.01）。PCG组Notch1、2、4，Hes，Jagged1，Delta4蛋白及mRNA表达低于Model组;Notch3，Delta1、3蛋白及mRNA表达高于Model组（P < 0.05或P < 0.01）。Model组P-STAT1、3、5、6蛋白及mRNA表达高于Control组;P-STAT4蛋白及mRNA表达低于Control组（均P < 0.01）。PCG组P-STAT1、3、5、6蛋白及mRNA表达低于Model，P-STAT4蛋白及mRNA表达高于Model组（均P < 0.01）。 结论 PCG通过调控Notch/STAT信号通路降低EOS含量治疗哮喘。

[关键词] 支气管哮喘;Notch/STAT信号通路;平喘颗粒;嗜酸性粒细胞

[中图分类号] R5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）10（a）-0022-06

Molecular mechanism of Pingchuan Granules regulated EOS for asthmatic based on Notch/STAT signaling pathway

REN Yuzhe1   YU Zhou1   CHEN Hong2   YANG Zeyi3   YANG Xiangzheng

1.Department of Pediatrics， Beijing University of Chinese Medicine， Guangdong Province， Shenzhen   518100， China; 2.Ward 1， Department of Pediatrics， the First Affiliated Hospital， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin   150040， China; 3.School of Tradition Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing   100029， China

[Abstract] Objective To investigate the therapeutic target and molecular mechanism of Pingchuan Granules in the treatment of asthma. Methods Eighty Wistar rats were randomly divided into Control group， Model group， Pingchuan Granule （PCG） group and Dexamethasone （DXMS） group， with 20 rats in each group. Asthma model rats were prepared by the method of combined inhalation of ovalbumin and aluminum hydroxide. Five days before the end of modeling， the corresponding drug intervention treatment was given by gavage. According to the modeling condition， ten of each group were selected for subsequent experiments. Bronchoalveolar lavage fluid （BALF） and serum eosinophilic granulocyte （EOS） counts， EOS cationic protein （ECP） and activated chemokine expression （Eotaxin） were compared among the four groups. Expression of proteins and mRNA related to Notch and STAT signaling pathways in lung were measured by RT-PCR and Western blot. Results BALF and serum EOS counts in Model group were higher than those in Control group （all P < 0.01）， BALF and serum EOS counts in PCG group were lower than those in Model group （all P < 0.01）. The content of ECP and Eotaxin in Model group were higher than those in Control group （all P < 0.01）， and the content of ECP and eotaxin in PCG were lower than those in Model group （P < 0.05 or P < 0.01）. Notch1， 2， 4， Hes， Jagged1， Delta4 protein and mRNA expression in Model group were higher than those in Control group， and the expression of Notch3， Delta1， 3 protein and mRNA were lower than those in Control group （all P < 0.01）. Notch1， 2， 4， Hes， Jagged1， Delta4 protein and mRNA expression in PCG group were lower than those in Model group and the expression of Notch3， Delta1， 3 protein and mRNA were higher than those in Model group （P < 0.05 or P < 0.01）. The expression of P-STAT1， 3， 5， 6 protein and mRNA in Model group were higher than those in Control group， and P-STAT4 protein and mRNA were lower than those in Control group （all P < 0.01）. The expression P-STAT1， 3， 5， 6 protein and mRNA in PCG group were lower than those in Model group， and P-STAT4 protein and mRNA were higher than those in Model group （all P < 0.01）. Conclusion PCG can reduce EOS by regulating Notch/STAT signaling pathway in the treatment of asthma.

[Key words] Bronchial asthma; Notch/STAT signaling pathway; Pingchuan Granules; Eosinophil

支气管哮喘是一种慢性炎症性气道疾病和气道高反应性为特征的异质性疾病，主要炎症成分为嗜酸性粒细胞（EOS）[1-2]。动物实验显示[3]，EOS浸润与气道反应性的增加显著相关，并继续在肺中积累和激活。研究报道称信号转导和转录激活因子（STAT）家族、Notch信号通路在哮喘的发病中与EOS的分化及增殖也密切相关[4-5]。目前其常用治疗为免疫抑制治疗，如激动剂、糖皮质激素、抗组胺药、基因治疗等[6]。尽管哮喘的治疗已取得了一些进展，但仍缺乏有效且副作用小的药物。

哮喘在中医归为“哮证”，以“发时治标，平时治本”为主要治则[7]。本课题组多年来致力于研究组方平喘颗粒（PCG），通过研究发现其在治疗肺功能方面临床效果显著。前期动物实验结果证实其具有平喘、镇咳、化痰等作用，但是关于PCG否通过调控Notch/STAT信号通路发挥作用有待进一步探究。

因此本研究通过建立哮喘动物模型以及细胞实验探究PCG对哮喘的改善作用，并进一步探讨其是否通过调控Notch/STAT信号通路影响EOS的分子机制。

1 对象与方法

1.1 实验动物

健康Wistar大鼠80只，雄性，8周龄，体重（200±20）g，购买于北京维通利华实验动物有限公司，动物合格证：11400700256012，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。饲养条件：室温22～26℃，相对湿度50%～70%，保持通风良好，黑白交替各12 h，自由摄食饮水，动物实验过程遵循“3R原则”以及人道关怀。

1.2 主要仪器与试剂

定量PCR仪（SimpliAmp，赛默飞）;全自动血液分析仪（HM，美国库克曼库尔股份有限公司）;PCR扩增仪（ATC，赛默飞）;Bio-Rad电泳仪（PowerPac系列，伯乐生命医学产品有限公司）。

卵清白蛋白（Sigma，O1641）;IgE酶联免疫试剂盒（Sigma，RAB0799）;ECP酶联免疫试剂盒[齐一生物科技（上海），QY-R2220]、Eotaxin酶联免疫试剂盒（Sigma，RAB0043）;乌拉坦（武汉宏信康精细化工，51-79-6）;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（Roche，11732650001）。PCG由黑龙江中医药大学附属第一医院提供（黑龙江中医药大学制剂室，150207），由淫羊藿15 g、黄芪10 g、款冬花12 g、炙麻黄10 g、太子参10 g、罂粟壳4 g、五味子10 g、知母10 g、地龙10 g组成。将其制备成每千克含91 g生药的颗粒，经换算大鼠的给药剂量为10 mL/kg。地塞米松磷酸钠注射液（DXMS，国药集团容生制药有限公司，1 mL：5 mg，11030022）。

1.3 实验分组与处理

1.3.1 哮喘模型的建立  Wistar大鼠适应性喂养7 d后，在实验的第0、12天，每只大鼠腹腔注射1 mg卵白蛋白（OVA）和100 mg氢氧化铝凝胶无菌耐浓缩液（1 mL）致敏，并用5% OVA连续刺激5 d，每次30 min，1次/d，5 d后隔天激发1次，刺激6周，建立慢性哮喘模型，成模率>90%，对照组腹腔注射相应体积的10% OVA溶液。

1.3.2 分组及给药  80只大鼠随机分为Control组、Model组、PCG组（5.4 g/kg）、DXMS组（1 mg/kg），每组20只。在造模结束前5 d开始给药，PCG组和DXMS组给予相应药物，Control组和Model组给予等量的蒸馏水，激发时在激发前1 h给予相应药物，1次/d。同时，每天观察动物的基本体征。造模给药结束后，每组根据成模情况取10只用于后续实验。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 实验动物取材  实验结束后，从腹主动脉收集血液，并将其放入乙二胺四乙酸抗凝管中。分离颈部血管和神经，暴露气管，切1个小V形开口，并进行气管插管。将右肺结扎，5 mL预冷磷酸盐缓冲液（PBS）灌洗左支气管，收集支气管肺泡灌洗溶液（BALF）。取肺组织，右肺上叶用4%多聚甲醛固定。液氮迅速冷冻右肺下叶组织以备使用。

组织匀浆：准确称取适量右肺下叶组织，加入9倍体积的缓冲溶液或氯化钠溶液于低温冷藏，后加1 mg/L蛋白酶抑制剂或50 U/mL抑肽酶，制成10%组织匀浆液（W/V），3000 r/min离心10 min（离心半径10 cm）。沉淀用于提取组织蛋白，上清液用于检测各种生化指标。

1.4.2 生理状态观察  根据体重调节大鼠的给药剂量，称重1次/3 d。同时，观察大鼠在刺激或致敏过程中的生理变化，如呼吸频率和精神状态等。

1.4.3 BALF及血清EOS计数  BALF以2000 r/min离心5 min（半径10 cm），弃去上清液，沉淀物稀释并重悬于1 mL预冷PBS中。混合抗凝管中的血液，放置20 min。通过自动五分类血液分析仪检测BALF及血清EOS计数。

1.4.4 血清EOS活化标志物检测  根据试剂盒说明书，对四组血清EOS活化标志物阳离子蛋白（ECP）、趋化因子（Eotaxin）进行检测。

1.4.5 BALF中EOS细胞的分离与培养  四组BALF液经处理获得EOS细胞。将分离和纯化的EOS细胞在含有10% FBS的RPMI 1640完全培养基中培养，将细胞浓度调节至2×105个/孔，添加10 U/mL白细胞介素-5，并置于培養板上，在5%CO2和37℃条件下进行培养。

1.4.6 EOS细胞的鉴定（Wright-Giemsa染色）  首先浆细胞涂片于拨片上、自然干燥;滴加瑞氏染液染1 min;加等体积的PBS（pH=6.4）混匀后室温静置5～10 min;水洗、干燥、镜检。

1.4.7 肺组织Notch、STAT信号通路相关蛋白表达的检测  称取肺组织进行研磨、离心得到蛋白上清液，BCA试剂盒检测组织总蛋白含量，加入loading上样缓冲液和裂解液进行定量，100℃水浴15 min。通过制胶、上样、电泳、转膜、封闭等操作后，一抗孵育过夜，二抗孵育，最后放置于化学发光成像仪曝光成像，检测Notch、STAT信号通路相关蛋白表达。

1.4.8 肺组织Notch、STAT信号通路相关mRNA表达的检测  取肺组织50 mg，匀浆后Trizol试剂提取总RNA，测其浓度和纯度。采用RT-PCR逆转录试剂盒获取cDNA，反应体系：1 μL Oligo（dT）18（0.5 μg/mL），10 μL 2×TS Reaction Mix TS Enzyme Mix，1 μL DNA 酶，20 μL RNase-free water至总体积为32 μL。根据试剂盒说明书操作进行扩增，对Notch、STAT和GAPDH基因进行引物序列设计，引物交由苏州金唯智生物科技有限公司（北京公司）合成，引物序列见表1。

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 5软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组一般行为学变化

Control组大鼠表现为亮发，活动正常，规律摄食摄水，正常呼吸频率，抓握时迅速逃脱;Model组大鼠进食减少，头发直立，稀疏干燥，呼吸急促常伴有喘息，呼吸频率增加，多数有咳嗽现象，腹部肌肉抽搐和烦躁不安。与Model组比较，DXMS、PCG组大鼠饮食增加，活动更容易移动，呼吸和喘息频率降低，毛发光泽，偶尔咳嗽，哮喘症状减轻。

2.2 四组BALF及血清EOS计数比较

Model组BALF及血清EOS计数高于Control组（均P < 0.01）;PCG组BALF及血清EOS计数低于Model组（均P < 0.01）。见表2。

2.3 四组ECP及Eotaxin含量比较

Model组ECP及Eotaxin含量高于Control组（均P < 0.01）;PCG组ECP及Eotaxin含量低于Model组（P < 0.05或P < 0.01）。见表3。

2.4 EOS形态鉴定

细胞着色均匀分布，细胞形态一致且均呈粉红色圆形，Wright-Giemsa染色呈阳性，提示分离所得细胞为EOS细胞，纯度检测显示其纯度均>95%。见图1（封四）。

2.5 四组Notch信号通路蛋白表达比较

Model组Notch1、2、4，Hes，Jagged1、2，Delta4蛋白表达高于Control组;Notch3，Delta1、3蛋白表达低于Control组（均P < 0.01）。PCG组Notch1、2、4，Hes，Jagged1，Delta4蛋白表达低于Model组;Notch3，Delta1、3蛋白表达高于Model组（P < 0.05或P < 0.01）。见图2。

2.6 四组STAT信号通路蛋白表达比较

Model组P-STAT1、3、5、6蛋白表達高于Control组，P-STAT4蛋白表达低于Control组（均P < 0.01）;PCG组P-STAT1、3、5、6蛋白表达低于Model组，P-STAT4蛋白表达高于Model组（均P < 0.01）。见图3。

2.7 四组Notch信号通路mRNA表达比较

Model组Notch1、2、4，Jagged1，Delta4，Hes mRNA表达高于Control组，Notch3，Delta1、3 mRNA表达低于Control组（均P < 0.01）;PCG组Notch1、2、4，Jagged1，Delta4，Hes mRNA表达低于Model组，Notch3，Delta1、3 mRNA表达高于Model组（P < 0.05或P < 0.01）。见图4。

2.8 四组STAT信号通路mRNA表达比较

Model组P-STAT1、3、5、6 mRNA表达高于Control组，P-STAT4 mRNA表达低于Control组（均P < 0.01）;PCG组P-STAT1、3、5、6 mRNA表达低于Model组，P-STAT4 mRNA表达高于Model组（均P < 0.01）。见图5。

3 讨论

哮喘是一种有EOS、肥大细胞、淋巴细胞等多种细胞参与的炎症性疾病，EOS在其中发挥关键作用[8-9]。本研究应用OVA与氢氧化铝联合吸入法建立哮喘大鼠模型，探究PCG对哮喘的治疗作用。现代药理学研究显示，哮喘模型中EOS在BALF[10-11]、肺部[12]、外周血液[13]表达均升高，且EOS脱颗粒产物ECP、活化刺激物Eotaxin在气道平滑肌、肺组织和血清表达升高[14-17]。本研究制备哮喘模型的肺组织和支气管中出现炎症细胞浸润、EOS过表达、气道重塑和肺组织损伤，提示IgE介导的哮喘模型复制成功[18-20]。本研究结果显示，PCG组BALF及血清EOS计数、ECP和Eotaxin显著下降（P < 0.05），推测PCG能够通过抑制EOS达到治疗支气管哮喘的目的。

支气管哮喘是由IgE介导的一种变态反应性气道炎症，EOS为其主要效应细胞，而Notch信号通路可以调节EOS的迁移和分化，由此推断Notch信号通路与哮喘的发生存在一定的关联[21-22]。赖天文等[23]研究结果显示，哮喘模型鼠中Notch及其配体显著增加，且Notch的靶基因Hes mRNA在血清及BALF中均显著性上调。本研究结果显示，PCG通过回调Notch信号通路Notch1、2、4，Delta1、3，Jagged1，Hes的表达，改善肺组织和气道炎症以及气道重塑。实际是通过改善肺部EOS中Notch信号通路的表达，即PCG的靶细胞为EOS，其调控的相关的靶点为Notch1、2、4，Delta1、3，Jagged1，Hes。因此推断PCG对哮喘模型中的EOS有调节作用，作用机制与Notch有关。

研究发现[24-25]，哮喘发病的中心环节EOS中存在STAT家族表达。阻断STAT信号通路的表达可抑制EOS细胞的趋化和黏附，从而抑制呼吸道EOS浸润控制哮喘发生[26-27]。本研究结果显示，PCG对STAT1、3、4、5、6蛋白和mRNA的表达均有显著改善作用，提示PCG通过上调P-STST4蛋白和mRNA的表达，下调P-STAT1、3、5、6蛋白和mRNA的表达实现对气道重塑和炎症的调控作用，即PCG通过调控肺组织STAT活性从而发挥改善哮喘的作用。因此推测PCG对哮喘模型中的EOS有调节作用，作用机制与STAT有关。

总之，PCG可通过减少EOS的数量，调节EOS的Notch和STAT信号通路中的许多环节从而改善超敏和炎症反应，并抑制气道重塑，从而达到改善大鼠哮喘模型的哮喘特征。

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（收稿日期：2020-04-17）