TLR4在临产前后孕妇外周血中的表达及与下游相关信号通路激活的关系

陈自喜 赵蕴芝 朱兆伟 张孟哲 李晓晓 相芬芬 吴蓉 康向东

[摘要] 目的 研究Toll样受体4（TLR4）在临产前后孕妇外周血中的表达及与下游相关信号通路激活的关系。方法 收集上海中医药大学附属普陀医院2018年3月—2019年8月收治住院的孕妇外周血及子宫肌组织，根据是否临产分为足月临产组（21例）和足月未临产组（20例）。采用流式细胞術、酶联免疫吸附法检测孕妇外周血TLR4的表达，RT-PCR法检测子宫肌组织中TLR4、收缩相关蛋白及核因子（NF）-κB、MAPK家族JNK、ERK、P38 mRNA表达并进行相关性分析。 结果 两组孕妇的年龄、孕龄、体重指数比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。两组孕妇的外周血中性粒细胞、单核细胞及血清TLR4表达水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。两组孕妇子宫肌组织中TLR4、CX43及OTR比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。两组孕妇NF-κB、ERK、P38、JNK mRNA水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。TLR4与收缩相关蛋白CX43、OTR和信号通路JNK、ERK、P38、NF-κB呈正相关（R2 = 0.619、0.416、0.438、0.426、0.55、0.332，均P < 0.01）。JNK、ERK、P38、NF-κB与收缩相关蛋白CX43呈正相关（R2 = 0.548、0.393、0.702、0.600，均P < 0.01）;与OTR呈正相关（R2 = 0.308、0.608、0.532、0.514，均P < 0.01）。结论 TLR4可能通过激活下游NF-κB/MAPK通路，促进收缩相关蛋白的表达，促进子宫收缩，在分娩启动中发挥重要作用。

[关键词] Toll样受体4;分娩;收缩相关蛋白;信号通路

[中图分类号] R714          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）10（a）-0010-04

Expression of TLR4 in maternal peripheral blood before and after parturition and its relationship with activation of downstream signaling pathways

CHEN Zixi1*   ZHAO Yunzhi2*   ZHU Zhaowei1   ZHANG Mengzhe1   LI Xiaoxiao1   XIANG Fenfen1   WU Rong1▲   KANG Xiangdong1▲

1.Department of Laboratory Medicine， Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai   200062， China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology， Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai   200062， China

[Abstract] Objective To analyze the expression of Toll-like receptor 4 （TLR4） in maternal peripheral blood before and after parturition and its relationship with activation of downstream signaling pathways. Methods The peripheral blood and uterine muscle tissue of pregnant women admitted to Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine from March 2018 to August 2019 were collected and divided into term labor group （21 cases） and term non labor group （20 cases） according to whether or not labor. The expression of TLR4 was detected by flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assay. RT-PCR was used to detect the expression of TLR4， contraction related protein， nuclear factor （NF）-κB， JNK， ERK and P38 mRNA in uterine muscle， and their relationships were analyzed. Results There was no significant difference in age， gestational age and body mass index between two groups （P > 0.05）. There were significant differences in the expression levels of peripheral blood neutrophils， monocytes and serum TLR4 between two groups （P < 0.05）. There were significant differences in TLR4， CX43 and OTR between two groups （P < 0.05）. There were significant differences in the mRNA levels of NF-κB， ERK， P38 and JNK between two groups （P < 0.05）. TLR4 was positively correlated with CX43， OTR， JNK， ERK， P38 and NF-κB （R2 = 0.619， 0.416， 0.438， 0.426， 0.55， 0.332， all P < 0.01）. JNK， ERK， P38 and NF-κB were positively correlated with CX43 （R2 = 0.548， 0.393， 0.702， 0.600， all P < 0.01）， JNK， ERK， P38 and NF-κB were positively correlated with OTR （R2 = 0.308， 0.608， 0.532， 0.514， all P < 0.01）. Conclusion TLR4 may play an important role in labor initiation by activating downstream NF-κB/MAPK pathway， promoting the expression of contraction related proteins and promoting uterine contraction.

[Key words] Toll-like receptor 4; Parturition; Contraction-associated protein; Signaling pathw

早产是指妊娠满28周但不足37周的分娩，全球早产的发生率为5%～18%[1]，我国发生率为8%[2-3]。早产和足月分娩有着共同的分娩机制，只是由于生殖道感染、宫内炎症[4-5]等导致分娩时间提前。及时阐明分娩启动的机制，有助于临床有效防治早产的发生。Toll样受体4（TLR4）是Toll样受体家族中重要的模式识别受体之一，在天然免疫中发挥重要作用[6-8]。研究发现，母胎界面存在TLR4表达，且表达量随着妊娠阶段不同而改变，TLR4介导母胎间的免疫耐受，参与宫内炎症反应过程[9]。此外，TLR4不仅与早产的发生密切相关，而且参与正常分娩过程[10-11]。本课题组前期研究发现，在早产和足月产的人绒毛膜组织中TLR4的表达明显升高[12]。为了进一步证实TLR4与分娩启动有关，笔者于临床上收集足月临产和足月未临产孕妇的外周血及子宫肌组织，初步探讨TLR4在分娩启动中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源

获得上海中医药大学附属普陀医院（以下简称“我院”）医学伦理委员会批准，在孕妇知情同意的前提下，收集2018年3月—2019年8月我院收治的孕妇外周血及子宫肌组织，根据是否临产分为足月临产组（21例）和足月未临产组（20例）。实验所需孕妇入选标准：孕妇年龄25～28岁，单胎，孕37～42周。排除标准：妊娠肥胖症、妊娠心血管疾病、妊娠高血压疾病、妊娠糖尿病等妊娠期合并症者。

1.2 样本处理

收集孕妇外周血3 mL于含EDTA试管和普通管中，在孕妇子宫下段行剖宫产术，待胎儿娩出，沿上缘切口近中线处取1.5 g子宫肌。放入-80℃冰箱，待后续实验进行操作。

1.3 仪器与试剂

ELISA试剂盒（江苏科特生物科技有限公司）;TLR4流式抗体（赛默飞世科技有限公司）;PCR反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒（天根生物科技有限公司）;引物由上海生工有限公司合成;荧光定量PCR仪（Applied Biosystems 7300）;流式细胞仪（BD FACSCanto），引物序列见表1。

1.4 检测方法

1.4.1 流式细胞术检测外周血单核细胞、中性粒细胞中TLR4表达  100 μL全血中加入10 μL的TLR4流式抗体，避光20 min，加入稀释后的溶血素混匀，避光10 min，1200 r/min离心5 min，离心半径13.5 cm，弃上清，加入2 mL的PBS，混匀，1200 r/min离心5 min，离心半径13.5 cm，弃上清，加入0.5 mL的PBS，1 h内上机检测。

1.4.2 酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清TLR4水平  外周血3500 r/min离心15 min，离心半径13.5 cm，吸取血清，按ELISA试剂盒说明书检测TLR4水平。

1.4.3 实时荧光定量PCR方法检测子宫肌组织中TLR4、CAPs及信号通路的表达  Trizol试剂抽提子宫肌组织中总RNA，测定提取的浓度和纯度，本研究所提取总RNA的质量和浓度均符合PCR反应要求。以β-actin为内参，RT-PCR法检测TLR4、CAPs及下游信号通路的表达。反应条件：95℃预变性30 s;95℃变性10 s;60℃退火20 s;70℃延伸10 s，共40个循环。利用2-ΔΔCt计算相对表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，采用Pearson进行相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组孕妇一般资料比较

两组孕妇的年龄、孕龄、体重指数比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.2 两组孕妇外周血中性粒细胞、单核细胞及血清TLR4表达水平比较

两组孕妇的外周血中性粒细胞、单核细胞及血清TLR4表达水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

2.3 两组孕妇子宫肌组织中TLR4及收缩相关蛋白mRNA水平比较

两组孕妇子宫肌组织中TLR4、CX43及OTR比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。

2.4 兩组孕妇子宫肌组织中NF-κB、ERK、P38、JNK mRNA水平比较

两组孕妇NF-κB、ERK、P38 mRNA水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表5。

2.5 TLR4与收缩相关蛋白及信号通路相关性分析

TLR4与收缩相关蛋白CX43、OTR和信号通路JNK、ERK、P38、NF-κB呈正相关（R2 = 0.619、0.416、0.438、0.426、0.55、0.332，P = 0.000、0.000、0.000、0.000、 0.000、0.000）。

2.6 信号通路与收缩相关蛋白相关性分析

JNK、ERK、P38、NF-κB与收缩相关蛋白CX43呈正相关（R2 = 0.548、0.393、0.702、0.600，P = 0.000、0.000、 0.000、0.000）;与OTR呈正相关（R2  = 0.308、0.608、0.532、 0.514，P = 0.000、0.000、0.000、0.000）。

3 讨论

妊娠满28周及以上胎儿从母体娩出的过程称为分娩。妊娠绝大数时期，在孕激素作用下子宫处于静息状态，到了妊娠末期，在收缩相关蛋白的作用下，子宫肌产生强烈而规律的收缩，使胎儿娩出[13]。分娩的发生与炎症反应密切相关，Toll样受体是天然免疫模式识别受体，可通过激活机体先天性免疫触发获得性免疫，在炎症反应中发挥作用[14]。研究发现，TLR4可通过上调促炎因子和趋化因子的表达促进早产发生[10]。有报道称，感染诱导的早产中白细胞变化与未感染足月分娩过程中白细胞变化相似，这些相似可归因于TLR4的直接或间接作用[15]。在妊娠末期，机体释放多种内源性因子激活TLR4，而TLR4激活是引起炎症级联反应驱动子宫激活的关键，而早产和足月产的人羊膜、绒毛膜中也检测到TLR4的表达[12，16]。本研究发现，足月临产孕妇的外周血及子宫肌组织中TLR4的表达明显升高，且与收缩相关蛋白之间呈显著正相关，结果提示，TLR4在人分娩启动中发挥重要作用。

研究发现，TLR4可调控NF-κB的活性介导炎症反应[17]。本研究发现，NF-κB与TLR4和收缩相关蛋白的表达呈正相关。这一发现提示，TLR4可能调控NF-κB通路介导炎症反应促进子宫激活。MAPK家族ERK和P38可促进NF-κB的激活和收缩相关蛋白表达[18-19]。研究还表明，TLR4可以诱导MAPK信号级联反应[20]。本研究发现，足月临产的人子宫肌组织中ERK、P38显著增加，且与TLR4和收缩相关蛋白的表达呈正相关。结果提示，TLR4可能通过激活NF-κB/MAPK通路调节炎症反应促进子宫激活。

综上，TLR4在足月分娩的人外周血及子宫平滑肌中上调，并与收缩相关蛋白及下游信号通路呈显著正相关，而信号通路的激活与子宫激活密切相关。TLR4可能通过激活下游NF-κB/MAPK信号通路，在子宫激活和分娩启动中起重要作用。

[参考文献]

[1]  You S，Cui AM，Hashmi SF，et al. Dysregulation of bile acids increases the risk for preterm birth in pregnant women [J]. Nat Commun，2020，11（1）：2111.

[2]  肖婧.黄体酮联合盐酸利托君治疗先兆早产效果观察[J].中国继续医学教育，2020，12（2）：138-141.

[3]  洪秀，盛晓园.早产发生率及高危因素及对围产结局的影响[J].中国医院统计，2019，26（1）：218-220.

[4]  平莉莉，张淑彦，翟淑芬.宫内感染早产儿脑损伤与血清炎症因子水平的相关性[J].儿科药学杂志，2019，1（8）：4-6.

[5]  王鑫，王婵，郑有宁.宫内感染早产儿血清及脑脊液炎性因子与脑损伤的关系[J].临床和实验医学杂志，2019，18（3）：290-292.

[6]  熊小菊，黄鹤.Toll样受体4与心血管疾病研究进展[J].中国心血管病研究杂志，2016，14（12）：1061-1064.

[7]  于莉，潘靖丹，杜娈英，等.TLR2和TLR4在抗病毒天然免疫应答中的新作用[J].病毒学报，2018，12（4）：570-578.

[8]  吴疑，匡梅，周红，等.TLR4信号通路及其负调控研究进展[J].现代医药卫生，2016，3（18）：2821-2824.

[9]  尹姝珂，李卫红.子宫内膜异位症相关细胞因子研究进展[J].大众科技，2017，19（5）：90-92.

[10]  孟楠，张思亚，黄琳，等.母胎界面微环境改变与早产[J].中国实用妇科与产科杂志，2018，34（2）：135-140.

[11]  黄坚，王珏，林珍云，等.Toll样受体2、3、4、9在胎盘组织中的表达及其与自发性早产的关系[J].浙江医学，2014， 36（7）：553-556.

[12]  张艺凡，李星，陈自喜，等.早产和足月产妊娠组织中Toll样受体表达水平及其下游信号通路激活的研究[J].医学临床专集，2017，2017：312-313.

[13]  李乐赛，周昌菊.子宫平滑肌收缩调控机制与分娩启动[J].中国妇幼健康研究，2011，22（5）：695-697.

[14]  朱学农，谭玉文，张玉梅，等.Toll样受体在先天性免疫反应中的作用[J].免疫学杂志，2006，22（3）：1-3.

[15]  Sarah A，Robertson，Hanan H，et al. Toll-like receptor 4：a new target for preterm labour pharmacotherapies？ [J]. Current Pharmaceutical Design，2018，24（9）：960-973.

[16]  曹耀辉.Toll受體4的表达与胎膜早破患者绒毛膜羊膜炎的关系[J].河北医药，2011，33（4）：565-566.

[17]  李爱玲，修瑞娟.Toll样受体4与原发性高血压的相关研究[J].医学综述，2014，20（11）：1937-1939.

[18]  陈昱晓，王娜，徐李玲，等.金桔精油通过抑制p38 MAPK和NF-κB信号通路减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤[J].广西医科大学学报，2019，36（6）：863-868.

[19]  陈湘玲，毕颖.产前血清微量元素含量与产后出血、MAPK信号分子和PGs表达、氧化应激的关系[J].医学院学报，2017，23（7）：928-931.

[20]  余镇河，朱昭琼.TLR4参与的炎症通路在术后认知功能障碍中的研究进展[J].遵义医科大学学报，2019，42（6）：722-726.

（收稿日期：2020-03-16）早产是指妊娠满28周但不足37周的分娩，全球早产的发生率为5%～18%[1]，我国发生率为8%[2-3]。早产和足月分娩有着共同的分娩机制，只是由于生殖道感染、宫内炎症[4-5]等导致分娩时间提前。及时阐明分娩启动的机制，有助于临床有效防治早产的发生。Toll样受体4（TLR4）是Toll样受体家族中重要的模式识别受体之一，在天然免疫中发挥重要作用[6-8]。研究发现，母胎界面存在TLR4表达，且表达量随着妊娠阶段不同而改变，TLR4介导母胎间的免疫耐受，参与宫内炎症反应过程[9]。此外，TLR4不仅与早产的发生密切相关，而且参与正常分娩过程[10-11]。本课题组前期研究发现，在早产和足月产的人绒毛膜组织中TLR4的表达明显升高[12]。为了进一步证实TLR4与分娩启动有关，笔者于临床上收集足月临产和足月未临产孕妇的外周血及子宫肌组织，初步探讨TLR4在分娩启动中的作用。

1 材料与方法

1.1 标本来源

获得上海中医药大学附属普陀医院（以下简称“我院”）医学伦理委员会批准，在孕妇知情同意的前提下，收集2018年3月—2019年8月我院收治的孕妇外周血及子宫肌组织，根据是否临产分为足月临产组（21例）和足月未临产组（20例）。实验所需孕妇入选标准：孕妇年龄25～28岁，单胎，孕37～42周。排除标准：妊娠肥胖症、妊娠心血管疾病、妊娠高血压疾病、妊娠糖尿病等妊娠期合并症者。

1.2 样本处理

收集孕妇外周血3 mL于含EDTA试管和普通管中，在孕妇子宫下段行剖宫产术，待胎儿娩出，沿上缘切口近中线处取1.5 g子宫肌。放入-80℃冰箱，待后续实验进行操作。

1.3 仪器与试剂

ELISA试剂盒（江苏科特生物科技有限公司）;TLR4流式抗体（赛默飞世科技有限公司）;PCR反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒（天根生物科技有限公司）;引物由上海生工有限公司合成;荧光定量PCR仪（Applied Biosystems 7300）;流式细胞仪（BD FACSCanto），引物序列见表1。

1.4 检测方法

1.4.1 流式细胞术检测外周血单核细胞、中性粒细胞中TLR4表达  100 μL全血中加入10 μL的TLR4流式抗体，避光20 min，加入稀释后的溶血素混匀，避光10 min，1200 r/min离心5 min，离心半径13.5 cm，弃上清，加入2 mL的PBS，混匀，1200 r/min离心5 min，离心半径13.5 cm，弃上清，加入0.5 mL的PBS，1 h内上机检测。

1.4.2 酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清TLR4水平  外周血3500 r/min离心15 min，离心半径13.5 cm，吸取血清，按ELISA试剂盒说明书检测TLR4水平。

1.4.3 实时荧光定量PCR方法检测子宫肌组织中TLR4、CAPs及信号通路的表达  Trizol试剂抽提子宫肌组织中总RNA，测定提取的浓度和纯度，本研究所提取总RNA的质量和浓度均符合PCR反应要求。以β-actin为内参，RT-PCR法检测TLR4、CAPs及下游信号通路的表达。反应条件：95℃预变性30 s;95℃变性10 s;60℃退火20 s;70℃延伸10 s，共40个循环。利用2-ΔΔCt计算相对表达量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，采用Pearson进行相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组孕妇一般资料比较

两组孕妇的年龄、孕龄、体重指数比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

表2   两组孕妇一般资料比较（x±s）

2.2 两组孕妇外周血中性粒细胞、单核细胞及血清TLR4表达水平比较

两组孕妇的外周血中性粒细胞、单核细胞及血清TLR4表达水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

表3   两组孕妇外周血中性粒细胞、单核细胞及血清TLR4

表达水平比较（x±s）

注：TLR4：Toll样受体4

2.3 两组孕妇子宫肌组织中TLR4及收缩相关蛋白mRNA水平比较

两组孕妇子宫肌组织中TLR4、CX43及OTR比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。

表4   两组孕妇子宫肌组织中TLR4及收缩相关蛋白

mRNA水平比较（x±s）

注：TLR4：Toll样受体4

2.4 两组孕妇子宫肌组织中NF-κB、ERK、P38、JNK mRNA水平比较

两组孕妇NF-κB、ERK、P38 mRNA水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表5。

表5   两组孕妇子宫肌组织中NF-κB、ERK、P38、

JNK mRNA水平比较（x±s）

注：NF-κB：核因子-κB

2.5 TLR4与收缩相关蛋白及信号通路相关性分析

TLR4与收缩相关蛋白CX43、OTR和信号通路JNK、ERK、P38、NF-κB呈正相关（R2 = 0.619、0.416、0.438、0.426、0.55、0.332，P = 0.000、0.000、0.000、0.000、 0.000、0.000）。

2.6 信号通路与收缩相关蛋白相关性分析

JNK、ERK、P38、NF-κB与收缩相关蛋白CX43呈正相关（R2 = 0.548、0.393、0.702、0.600，P = 0.000、0.000、 0.000、0.000）;与OTR呈正相关（R2  = 0.308、0.608、0.532、 0.514，P = 0.000、0.000、0.000、0.000）。

3 讨论

妊娠满28周及以上胎兒从母体娩出的过程称为分娩。妊娠绝大数时期，在孕激素作用下子宫处于静息状态，到了妊娠末期，在收缩相关蛋白的作用下，子宫肌产生强烈而规律的收缩，使胎儿娩出[13]。分娩的发生与炎症反应密切相关，Toll样受体是天然免疫模式识别受体，可通过激活机体先天性免疫触发获得性免疫，在炎症反应中发挥作用[14]。研究发现，TLR4可通过上调促炎因子和趋化因子的表达促进早产发生[10]。有报道称，感染诱导的早产中白细胞变化与未感染足月分娩过程中白细胞变化相似，这些相似可归因于TLR4的直接或间接作用[15]。在妊娠末期，机体释放多种内源性因子激活TLR4，而TLR4激活是引起炎症级联反应驱动子宫激活的关键，而早产和足月产的人羊膜、绒毛膜中也检测到TLR4的表达[12，16]。本研究发现，足月临产孕妇的外周血及子宫肌组织中TLR4的表达明显升高，且与收缩相关蛋白之间呈显著正相关，结果提示，TLR4在人分娩启动中发挥重要作用。

研究发现，TLR4可调控NF-κB的活性介导炎症反应[17]。本研究发现，NF-κB与TLR4和收缩相关蛋白的表达呈正相关。这一发现提示，TLR4可能调控NF-κB通路介导炎症反应促进子宫激活。MAPK家族ERK和P38可促进NF-κB的激活和收缩相关蛋白表达[18-19]。研究还表明，TLR4可以诱导MAPK信号级联反应[20]。本研究发现，足月临产的人子宫肌组织中ERK、P38显著增加，且与TLR4和收缩相关蛋白的表达呈正相关。结果提示，TLR4可能通过激活NF-κB/MAPK通路调节炎症反应促进子宫激活。

综上，TLR4在足月分娩的人外周血及子宫平滑肌中上调，并与收缩相关蛋白及下游信号通路呈显著正相关，而信号通路的激活与子宫激活密切相关。TLR4可能通过激活下游NF-κB/MAPK信号通路，在子宫激活和分娩启动中起重要作用。

[参考文献]

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[4]  平莉莉，张淑彦，翟淑芬.宫内感染早产儿脑损伤与血清炎症因子水平的相关性[J].儿科药学杂志，2019，1（8）：4-6.

[5]  王鑫，王婵，郑有宁.宫内感染早产儿血清及脑脊液炎性因子与脑损伤的关系[J].临床和实验医学杂志，2019，18（3）：290-292.

[6]  熊小菊，黄鹤.Toll样受体4与心血管疾病研究进展[J].中国心血管病研究杂志，2016，14（12）：1061-1064.

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[8]  吴疑，匡梅，周红，等.TLR4信号通路及其负调控研究进展[J].现代医药卫生，2016，3（18）：2821-2824.

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[12]  张艺凡，李星，陈自喜，等.早产和足月产妊娠组织中Toll样受体表达水平及其下游信号通路激活的研究[J].医学临床专集，2017，2017：312-313.

[13]  李乐赛，周昌菊.子宫平滑肌收缩调控机制与分娩启动[J].中国妇幼健康研究，2011，22（5）：695-697.

[14]  朱学农，谭玉文，张玉梅，等.Toll样受体在先天性免疫反应中的作用[J].免疫学杂志，2006，22（3）：1-3.

[15]  Sarah A，Robertson，Hanan H，et al. Toll-like receptor 4：a new target for preterm labour pharmacotherapies？ [J]. Current Pharmaceutical Design，2018，24（9）：960-973.

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（收稿日期：2020-03-16）