猴头菇维生素D2纳米脂质体的制备与分析

毛荣良 李 珅 杨 开 李云涛 黄良水 孙培龙*

猴头菇维生素D2纳米脂质体的制备与分析

毛荣良1李 珅2杨 开2李云涛1黄良水3孙培龙2*

（1. 常山县豪锋农业发展有限公司，浙江 衢州 324207；2. 浙江工业大学食品科学与工程学院，杭州 310014;3. 常山县天乐食用菌研究所，浙江 衢州 324200）

为提高猴头菇维生素D2的稳定性和生物利用率，以猴头菇麦角甾醇提取液经UVC照射并冻干处理获得的样品为原料，制备维生素D2纳米结构脂质体（H-VD2-NLC）和固体脂质纳米粒（H-VD2-SLN）两种纳米脂质载体。经测定不同高压均质循环次数下的纳米脂质体粒径、聚合物分散性指数（PDI）、ζ电位、表面形态、熔点、结晶点和包封率，发现H-VD2-NLC和H-VD2-SLN分别在5次和7次高压均质循环时达到相对稳定状态，其包封率分别为32.74%±0.18%和10.68%±0.23%，H-VD2-NLC比H-VD2-SLN更适合作为猴头菇维生素D2纳米脂质体。

猴头菇；维生素D2；纳米脂质体；高压均质；包封率

维生素D（vitamin D，简称VD）包括维生素D2（麦角骨化醇，VD2）和维生素D3（胆骨化醇，VD3）两种活性物质结构。随着城市化进程的加速和生活方式的改变，居民户外活动时间日趋减少，进而影响到机体维生素D的合成[1]。VD缺乏是困扰全世界的公共健康问题，目前全球约有10亿人摄取不足[2]。现代医学及营养学研究表明：VD缺乏不仅会引起体内钙磷代谢障碍、佝偻病、软骨病和骨质疏松等骨骼系统疾病，而且还可能引发癌症、免疫系统疾病、心血管疾病、代谢性疾病（Ⅱ型糖尿病和肥胖症）、肌肉功能障碍和易跌倒等骨外系统疾病[3, 4]。合理补充VD可以降低患病的风险[5]。

虽然化学合成的VD价格较为低廉，但人们更偏爱和追求天然健康食品，天然VD不仅价格高，而且市场份额不断增大。天然VD2仅存在于真菌界，食用菌中含有丰富的VD2原“麦角固醇”，在紫外光的照射下可转化为VD2，相比海洋生物中的VD3，其更为大多数素食者所接受。笔者前期对4种食用菌进行紫外光（UV）与脉冲强光（IPL）照射麦角甾醇转化VD2研究[6]，发现猴头菇（）经短波紫外线（UVC）照射的VD2含量最高。

然而，VD2性质不稳定，遇光、热、氧等易降解而失效，导致生物利用率降低，从而限制了其在药品、食品、保健食品等领域的广泛应用。有人采用β-环糊精包埋[7]、添加抗氧化剂[8]或天然植物提取物[9]等方式对其进行稳定性保护研究。纳米维生素是通过特殊工艺加工，使脂溶性维生素形成粒径20～200 nm的分子微团，可以乳液等形式对维生素进行包裹，减少降解，极大改善其在水中的溶解性、分散性和透析性能，并能发挥一定的缓释功效，促进维生素在体内的吸收利用[10, 11]。目前，对VD3纳米乳化等的研究较多[11-15]，而关于VD2纳米脂质体制备的报道尚属少见。

本研究对猴头菇麦角甾醇提取液经UVC照射处理及冻干后得到的VD2冻干物，采用纳米结构脂质载体（nanostructured lipid carriers，NLC）和固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）两种方式制备猴头菇纳米脂质体，并表征其粒径和ζ-电位等理化性质，以期为相关食用菌VD2剂型及产品开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猴头菇VD2冻干物（H-VD2）的制备方法[6]：将猴头菇麦角甾醇提取液用UVC照射，然后经72 h冷冻干燥获得。经HPLC检测，VD2含量为55.7 μg/g。

甘油单硬脂酸酯（GMS）、油酸（OA）、吐温-80、吐温-20及三棕榈酸甘油酯，均购自上海阿拉丁试剂有限公司；色谱纯甲醇和二氯甲烷，购自天津四友化学试剂有限公司；无水乙醇、氢氧化钾等其余试剂均为分析纯，购自上海凌峰试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

Alpha 2-4 LD Plus冻干机，德国Christ公司；Axiovert 25 CFL光学显微镜，北京瑞科中仪科技有限公司；Tecnai G2 F30透射电镜（TEM），荷兰FEI公司；Zetasizer Nano-ZS纳米粒度及电位分析仪，英国Malvern公司；Q20P差示量热扫描仪，美国TA仪器，沃特世科技（上海）有限公司；PT-MR2100高速剪切机，瑞士Kinematica公司；M-110L高压均质机，美国Microfluidics公司；Waters1525型高效液相色谱（HPLC）分析仪，美国Waters有限公司；Cosmosil C18高效液相色谱柱（250 mm×4.6 mm），北京英莱克科技发展有限公司；ME204E电子天平，梅特勒-托利多精密仪器制造公司；RE-2000A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；DK-S24型电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；UV-Int150紫外能量计，深圳致佳仪器设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 H-VD2-NLC的制备

采用Sung等[16]的方法并略作修改，制备猴头菇VD2纳米结构脂质体（H-VD2-NLC）。

（1）油相制备。准确称取2.5 g油酸、6 g甘油单硬脂酸酯于500 mL烧杯中，水浴锅加热至60 ℃，准确称取0.5 g猴头菇VD2冻干物溶于其中。

（2）水相制备。准确称取170 g双蒸水、8.5 g吐温-80活性剂于500 mL烧杯中，水浴锅加热至60 ℃。

（3）NLC的制备。将已分别加热至60 ℃的水相加入到油相中进行混合，并使用PT-MR2100高速剪切机匀化1 min。随后，将该混合物用M-110 L高压均质机进行高压（75 MPa）均质10个循环。适量收集每次循环时的样品，以供后续检测。在第10次循环结束时，将热乳剂立即在冰水浴中冷却至约0 ℃，制得H-VD2-NLC。

1.3.2 H-VD2-SLN的制备

采用Liedtke等[17]的方法并略作修改，制备猴头菇VD2固体脂质纳米粒（H-VD2-SLN）。

（1）油相制备。准确称取9.75 g三棕榈酸甘油酯于500 mL烧杯中，水浴锅加热至60 ℃；准确称取0.25 g 猴头菇VD2冻干物溶于其中。

（2）水相制备。准确称取180 g双蒸水、10 g吐温-20活性剂于500 mL烧杯中，水浴锅加热至60 ℃。

（3）脂质体的制备。H-VD2-SLN制备方法同1.3.1（3）项。

1.3.3 粒径和电位测定

（1）粒径和Zeta电位。使用Zetasizer Nano-ZS纳米粒度及电位ζ分析仪的动态光散射（DLS），在10 ℃下分别测量H-VD2-NLC和H-VD2-SLN的粒径、聚合物分散性指数和ζ电位。样品预处理方法：分别使用蒸馏水对H-VD2-NLC样品以1∶9（pH 6.5）和对H-VD2-SLN样品以1∶100进行稀释，再分别经涡旋振荡30 s后进行粒度分析。

1.3.4 TEM（透射电镜）分析

采用透射电子显微镜（TEM）测定H-VD2-NLC和H-VD2-SLN的形态，在100 kV和80 000倍下成像。样品预处理方法如下：

（1）H-VD2-NLC样品预处理。将一滴H-VD2-NLC样品置于铜网上，用滤纸除去过量液体，而后用1%（/）乙酸铀酰将网格染色3 min，用滤纸吸干多余染色液，静置风干后使用TEM进行观察。

（2）H-VD2-SLN样品预处理。将 H-VD2-SLN的样品以1∶10稀释，取一滴样品稀释液置于铜网上，并滴入2滴2%乙酸铀酰染色，用滤纸吸干多余染色液，静置风干后使用TEM进行观察。

1.3.5 纳米脂质体的熔点和结晶点测定

采用差示扫描量热法（DSC）测定猴头菇纳米脂质体的多晶型物及其熔融焓。将8～12 mg样品（H-VD2-NLC，H-VD2-SLN）置于铝盘中，并将盖子密封，以空的密封盘为对照。将铝盘放入量热仪中，在20 ℃下平衡。以10 ℃/min的速度将锅加热至120 ℃，分别观察H-VD2-NLC和H-VD2-SLN的熔点；以相同的速率冷却至5 ℃，观察纳米脂质体结晶点。

1.3.6 VD2包封率（encapsulation efficiency，EE）测定

采用高效液相色谱法（HPLC）[6]测定H-VD2-NLC和H-VD2-SLN的包封率。于25 ℃下，将H-VD2-NLC和H-VD2-SLN在己烷中搅拌2 h，并以10 000 r/min离心10 min。将得到的上清液与甲醇以1∶9（/）比例混合，经HPLC法分析游离VD2的含量。包封率（EE）使用以下公式计算：

式中，T为VD2总量；F为游离的VD2含量。

2 结果与分析

2.1 粒径

经75 MPa高压均质循环处理1次，H-VD2-NLC和H-VD2-SLN的粒径分别为98.23±3.16 nm和61.11±4.23 nm；当高压均质循环次数达到10次时，H-VD2-SLN的粒径减小到37.84±3.25 nm，而H-VD2-NLC的粒径仅减小到60.12±2.37 nm（图1）。无论是H-VD2-NLC还是H-VD2-SLN，其粒径均随着高压均质循环次数的增加而减小，并逐步趋于稳定，且H-VD2-NLC的粒径始终大于H-VD2-SLN的粒径。所制备的两种脂质体粒径均在20～200 nm，符合纳米脂质体的粒径要求。

图1 高压均质循环次数对猴头菇纳米脂质体粒径的影响

图2 高压均质循环次数对猴头菇纳米脂质体PDI的影响

图3 高压均质循环次数对猴头菇纳米脂质体ζ-电位的影响

2.2 聚合物分散性指数（PDI）

由图2可知，H-VD2-NLC经75 MPa高压循环均质处理1次，PDI为0.351±0.014；随着均质循环次数增加，PDI不断减小，循环5次时，PDI降到最小，为0.256±0.013，表明H-VD2-NLC粒径分布达到较好均匀状态；继续均质，PDI增大，粒径的均匀性变差。H-VD2-SLN经1次均质循环的PDI为0.487±0.015；其PDI随着均质循环次数的增加而减小，在循环7次时出现最小值0.362±0.014，表明H-VD2-SLN粒径分布达到较好均匀状态；继续均质，PDI增大，粒径的均匀性变差。H-VD2-NLC的PDI始终小于H-VD2-SLN，表明其粒径分布范围比H-VD2-SLN的窄，粒径的均匀性更好。

2.3 ζ-电位

如图3所示，H-VD2-NLC经75 MPa高压均质循环处理1次，ζ-电位为-12.45±0.45 mV；随着均质循环次数增加，ζ-电位（绝对值）不断增加，循环5次时，ζ-电位达到最大值-14.23±0.44 mV，获得相对稳定的溶液体系；均质循环次数继续增加，ζ-电位开始减小。H-VD2-SLN的ζ-电位在1次均质循环时为-9.71±0.34 mV，并随着均质循环次数的增加而增加，循环7次时达到最大值-11.52±0.32 mV，获得相对稳定的溶液体系，继续循环则ζ-电位减小。在同样均质循环次数处理下，H-VD2-NLC的ζ-电位始终大于H-VD2-SLN，表明其具有比H-VD2-SLN更加稳定的溶液体系。

2.4 透射电镜（TEM）

经5次高压均质循环处理的H-VD2-NLC透射电镜结果（图4），此时H-VD2-NLC由纳米结构脂质载体包裹，呈现球状脂质体，其中包裹着数量不等的VD2。H-VD2-NLC粒径尺寸为72.38±0.11 nm。经7次高压均质循环处理的H-VD2-SLN透射电镜结果（图5），H-VD2-SLN呈不规则的饼状和棒状，粒径在45.11±0.12 nm左右。

图4 H-VD2-NLC透射电镜图

图5 H-VD2-SLN透射电镜图

2.5 熔点和结晶点

H-VD2-NLC和H-VD2-SLN经前述得到的最佳高压均质条件处理后进行DSC测定的结果（图6），经5次高压均质循环处理的H-VD2-NLC结晶温度为39.03 ℃，熔融温度为56.82 ℃；经7次高压均质循环处理的H-VD2-SLN结晶温度为37.33 ℃，熔融温度为64.02 ℃。两种纳米脂质体的熔点和结晶点不同，应该是由于采用不同辅料和不同制备方法所致。

A：结晶循环；B：熔融循环。

2.6 包封率（EE）

采用HPLC对H-VD2-NLC和H-VD2-SLN中的游离VD2进行测定的结果，经5次高压均质循环处理的H-VD2-NLC包封率为32.74%±0.18%，极显著高于（＜0.01）经7次高压均质循环处理的H-VD2-SLN包封率（10.68%±0.23%）。因此，相比固体脂质纳米粒制备方法，纳米结构脂质载体法更适于猴头菇纳米脂质体的制备。但因本研究样品VD2含量较低，包封率远低于用纯品VD制备的纳米脂质载体[13, 16]。

3 结 论

以猴头菇麦角甾醇提取液经UVC照射并冻干获得的样品为VD2原料，通过油酸、甘油单硬脂酸酯和吐温-80混合制备的H-VD2-NLC和通过三棕榈酸甘油酯和吐温-20混合制备的H-VD2-SLN。随着高压均质循环次数的增多，这两种纳米脂质体的粒径均呈逐渐减小趋势，分散性指数（PDI）呈先降低后增长的趋势，而ζ-电位（绝对值）则呈先升高后降低趋势。

H-VD2-NLC在5次高压均质循环时达到相对稳定状态，此时PDI为0.256±0.013，粒径为72.38±0.11 nm，包封率为32.74%±0.18%，结晶温度为39.03 ℃，熔融温度为56.82 ℃。H-VD2-SLN在7次高压均质循环时达到相对稳定状态，此时PDI为0.362±0.014，ζ-电位为-11.52±0.32 mV，粒径为45.11±0.12 nm，包封率为10.68%±0.23%，结晶温度为37.33 ℃，熔融温度为64.02 ℃。在此优化条件下，H-VD2-NLC具有比H-VD2-SLN更稳定的体系，且包封率是后者的2倍多。后续将对H-VD2-NLC的光、热、氧等的稳定性及生物利用率进行更深入的研究。

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Preparation Nano-liposome of VD2from

Mao Rongliang1Li Shen2Yang Kai2Li Yuntao1Huang Liangshui3Sun Peilong2*

（1. Changshan Haofeng Agricultural Development Co. LTD, Quzhou, Zhejiang 324207, China; 2. College of Food Science and Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou, Zhejiang 310014, China; 3.Research Institute of Changshan Tianle Edible Fungus, Quzhou, Zhejiang 324200, China）

In order to improve the stability and bioavailability of VD2from, the lyophilized sample of ergosterol extract fromtreated with ultraviolet C irradiation was used as raw VD2materials to prepare two kinds of nano-liposome: the nano-structured liposomes (H-VD2-NLC) and solid lipid nanoparticles (H-VD2-SLN). By analysis number of high pressure homogeneous processing and properties of nano-liposome, including particle size, polymer dispersion index (PDI), zeta potential, surface morphology, melting and crystallization point, encapsulation efficiency, H-VD2-NLC and H-VD2-SLN were found to be a relatively stable state when high pressure homogeneous was five times and seven times, respectively. And at above optimal conditions, the encapsulation efficiency rate of H-VD2-NLC and H-VD2-SLN was 32.74% ± 0.18% and 10.68% ± 0.23%, respectively. In conclusion, H-VD2-NLC was a better alternative than H-VD2-SLN in preparation ofVD2nano-liposome.

; vitamin D2; nano-liposome; high pressure homogeneous; encapsulation efficiency

S646

B

2095-0934（2020）06-440-06

浙江省科技厅重点研发计划项目（2019C02040）

毛荣良（1963—），男，农技师，常山县豪锋农业发展有限公司，主要从事食药用菌栽培及产品开发。E-mail：13867012399@139.com。

孙培龙（1664—），男，教授，浙江工业大学食品科学与工程学院，主要从事食药用菌的精深加工研究。E-mail：sun_pl@zjut.edu.cn。