艰难梭菌实验室诊断方法研究进展

谢 乐，刘善文，张 宁，张淑芳*

(1 山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000；2 临沂市人民医院)

艰难梭菌是胃肠道最常见的条件性致病菌。长期应用抗生素、化疗药物的患者，其肠道正常菌群生长受抑制，艰难梭菌会乘机繁殖并释放毒素，引起相关性腹泻，轻者呈自限性腹泻，重者可引起伪膜性肠炎[1]。艰难梭菌相关性腹泻占抗生素相关性腹泻的20%～30%[2]。艰难梭菌在欧美国家已经被列为法定传染病的监测病原体，国内医院对艰难梭菌进行常规检验的较少。为此，本文对艰难梭菌的实验室检测方法进行了综述。

1 艰难梭菌致病机制

艰难梭菌是专性厌氧菌，营养要求高，其致病决定区(Pathogenicity locus，PaLoc)由tcdA、tcdB、tcdC、tcdE和tcdR组成，长度为19.6 kb，其中tcdA编码A毒素，作为肠毒素能趋化中性粒细胞聚集，导致液体大量分泌入肠腔；tcdB编码B毒素，作为细胞毒素可以破坏细胞骨架，引起肠细胞坏死。艰难梭菌大多含有tcdA、tcdB基因，部分tcdA基因片段缺失[3]。tcdC为负向调控基因，其缺失可引起tcdA、tcdB基因高表达。tcdR为正向调控基因，与tcdC基因作用相反。tcdE基因是一种膜孔蛋白编码基因，该蛋白可促进A、B毒素分泌。此外，部分高致病性艰难梭菌菌株还可分泌二元毒素(Clostridium difficile transferase，CDT)，由cdtA和cdtB编码，位于CdtLoc(CDT locus)基因上。PaLoc存在于所有产毒艰难梭菌中，而CdtLoc只存在部分产毒或不产毒株中。

2 实验室检测

2.1微生物学方法

2.1.1厌氧培养 艰难梭菌典型的菌落外观呈黄色扁平状，边缘不规则，并且有典型的马粪气味，镜下为粗大芽孢杆菌，在360 nm紫外灯照射下菌落发黄绿色荧光。实验室中常用CCFA(环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂)培养基。ChromID CD agar(IDCd；bioMerieux SA，France)，是一种显色培养基，艰难梭菌在平板上呈黑色，并且大部分的检测能在24 h内完成，其24 h和48 h的检测敏感性可达91.9%、97.3%[4]。厌氧培养敏感度高、特异性强，但是不能区分产毒艰难梭菌和非产毒艰难梭菌，并且耗时比较长，不能快速有效的为临床诊断提供依据。

2.1.2产毒素培养 产毒素培养(TC)分为两步，首先通过厌氧培养分离得到艰难梭菌，然后利用PCR方法检测毒素基因或者利用免疫方法进行艰难梭菌毒素检测。产毒培养的敏感性和特异性都比较高，SHEA/IDSA指南将产毒培养方法作为检测的金标准。由于产毒素培养检测时间长、操作复杂，需要专业的工作人员，限制了其在临床上的使用。

2.1.3细胞毒素中和试验 细胞毒素中和试验(CCNA)是直接检测粪便标本中的毒素。对粪便标本进行稀释并过滤，过滤液与培养细胞(常用Vero细胞)孵育24～48 h后观察细胞病变，若有≥50%的细胞出现病理改变，则在反应池中加入毒素特异性抗体孵育0.5 h，如果细胞的病理改变消失，就表示艰难梭菌毒素阳性。CCNA的检测操作复杂，敏感性较低，结果判读主观性强[5]，难以标准化，再加上检测费用高，所以较难在临床上推广使用。

2.2免疫学方法

2.2.1谷氨酸脱氢酶 谷氨酸脱氢酶(GDH)作为一种代谢酶，普遍存在于艰难梭菌表面(包括产毒和非产毒素菌株)，在粪便标本中的量较多并且稳定性较高，可作为粪便中艰难梭菌检测的指标。GDH检测方法灵敏度和阴性预测值高，由于产毒和非产毒艰难梭菌均能表达GDH，所以特异性低。如果GDH检测结果为阳性，可进一步判断其是否产生毒素；若检测结果为阴性则可基本排除，这样大大缩短了阴性标本的检测时间。

2.2.2EIA方法 许多商品化试剂盒大都使用EIA方法检测艰难梭菌产生的毒素A/B，其操作简单，用时短，价格相对较低。由于直接检测的是标本中的毒素，所以该方法的特异性高，但是敏感性低[6]。

免疫学方法检测艰难梭菌，操作简单，对工作人员的专业要求不高并且结果易于判读，但是其敏感性或特异性低，不能单独用于诊断[7]。为了提高诊断的准确性，临床上将GDH、EIA法作为初筛，阳性标本再用分子生物学方法进行检测。

2.3分子生物学方法

2.3.1聚合酶链反应(PCR)法 用普通PCR法直接检测粪便标本中的艰难梭菌毒素基因，该方法检测敏感性高、时间短(3～5 h)，但是扩增的产物需要电泳判断结果，会造成污染。有研究报道，实时荧光定量PCR检测艰难梭菌的灵敏性和特异性达到100%和98.3%[8]，大约3 h即可检测完成，是一种非常有效的检测方法。

2.3.2环介导等温扩增(LAMP) LAMP检测的基因是tcdA基因的一个片段。当特异性扩增产物形成时，形成肉眼可见的絮状沉淀，通过反应管的透光率实时监测。该方法敏感性和特异性比较高[9]，仪器设备简单，可以在等温条件下持续扩增，1 h即可完成检测，扩增产物量多，对人员的要求不高，大部分实验室都能满足这个条件。但是对tcdA(-)的菌株没法检测，影响其准确度。

分子生物学方法是直接检测的粪便标本中的艰难梭菌毒素基因，其检测时间短，敏感性和特异性比EIA方法高。但是该方法存在假阳性，有的患者虽然有产毒艰难梭菌定植，但是并没有出现腹泻等临床症状。

综上所述，检测艰难梭菌的三种方法所需的检测时间、对工作人员的要求、敏感度与特异度差异较大。将两种或三种方法联合使用，能提高检测的准确性。