养精胶囊通过PI3K-Akt-Cyclin D1 通路促进小鼠精原干细胞的增殖

蔡 滨 金保方 孙大林 邓伟民

东南大学附属中大医院中西医结合男科（江苏南京 210009）

精子发生是一个高度协调、有序进行的过程，精原干细胞（spermatogonia stem cells，SSCs）的自我更新与分化是精子发生的基础[1]。 SSCs 通过源源不断地增殖为精子发生提供稳定的原料， 而细胞周期的准确调控对SSCs 的增殖具有决定性作用[2]。 细胞周期蛋白（cyclin）通过与相应的细胞周期蛋白依赖激酶（cyclin dependent kinase，CDK）结合形成具有蛋白激酶活性的异源二聚体复合物，推动细胞周期各时相的有序进行。 研究表明，PI3K-Akt-Cyclin D 通路在SSCs 的增殖中扮演重要角色， 一些细胞因子如胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）可以通过磷脂酰肌醇3- 激酶 (phosphatidylinositol 3-kinaseA，PI3K)/ 蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）通路促进Cyclin D 的表达，进而促进SSCs 的增殖[3-5]。

养精胶囊（Yangjiing Capsule，YC）是我们在临床上常用的方剂，用于治疗由少弱精子症导致的男性不育，疗效确切。 为此，我们进行了一系列基础研究，发现养精胶囊作用于小鼠SSCs 48 h 后，细胞周期中S 期细胞比例明显增加，说明养精胶囊能够促进小鼠SSCs 由G1期向S 期的过渡，进而促进细胞增殖[6]。 进一步研究发现，养精胶囊可以与GDNF 的受体（GDNF family receptor alpha-1）结合，通过PI3K-Akt 通路，促进小鼠SSCs增殖[7]，但其下游的机制不清。

鉴于Cyclin D 在SSCs 增殖中的重要作用，我们猜测养精胶囊可能通过PI3K-Akt 通路作用于Cyclin D发挥作用。 因此，本研究的目的是研究养精胶囊是否通过PI3K-Akt 通路促进Cyclin D 的表达，进而促进SSCs的增殖。

材料与方法

一、细胞分离及培养

取4～6 d 雄性BALB/c 小鼠的睾丸，运用改良的两步消化法和差速贴壁分选获得高度纯化的SSCs， 种植到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，每2 d 更换培养液1次。 具体步骤见参考文献[8]。

二、主要试剂与药品

CCK-8 试剂盒、细胞周期试剂盒、细胞裂解及蛋白抽提试剂盒、Western 检测相关试剂、LY294002（PI3K抑制剂）（碧云天，中国）；细胞总RNA 提取试剂（Trizol法）、反转录试剂盒、定量PCR 检测试剂盒（诺唯赞，中国）；重组小鼠GDNF（Pepro Tech，美国）；兔抗鼠Cyclin D1 抗体（ab16663）、兔抗鼠Cyclin D2 抗体（ab230883），兔抗鼠Cyclin D3 抗体（ab112034）（Abcam，美国）；兔抗鼠Akt 抗 体（4685S）、 兔 抗 鼠p-Akt 抗 体（Ser473，4060S），兔抗鼠β-actin 抗体（4970S）（CST，美国）；养精胶囊由南京军区南京总医院制剂科生产提供[院临（2004）第01002 号]。 养精胶囊水提物提取方法见参考文献[7]。

三、细胞阻断实验

委托上海捷瑞生物工程有限公司设计针对Cyclin D1 基因的干扰RNA（siRNA）序列，同时设计一条阴性对照（siRNA-NC）序列，通过BLAST 验证该序列对于其他基因无干扰效果：

转染siRNA-Cyclin D1 之前先将SSCs 以1×105/孔接种至六孔板中，待细胞长至60%密度时采用Lipofectamine 3000（Invitrogen，美国）将siRNA-Cyclin D1/siRNA-NC 转染进细胞，37 ℃孵育24 h 后加入养精胶囊提取液继续培养48 h 进行后续检测。

采用LY294002 进行PI3K 阻断实验，SSCs 以1×105/孔接种至六孔板中，将25 μM 的LY294002 预先加入六孔板中培养2 h，之后加入养精胶囊提取液继续培养48 h 进行后续检测。

四、细胞增殖检测

在96 孔板中以4×103/ 孔的密度接种细胞悬液，放在培养箱中预培养24 h， 不同实验组处理后向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液， 然后将培养板置于培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度。 细胞增殖率=[(实验孔吸光度- 空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。

五、细胞周期检测

处理后的细胞在冰浴预冷的70%乙醇中重悬，4℃固定过夜。1000 g 左右离心3 min 沉淀细胞，之后加入冰浴预冷的PBS 重悬细胞， 每管细胞样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色复合液，37 ℃避光温浴30 min。 然后使用FACScan 流式细胞仪对样本进行分析， 采用ModFit LT 3.0 软件评价G0/G1期、S 期、G2/M 期细胞百分比。

六、实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）

处理后的细胞用Trizol 试剂提取总RNA， 之后用反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA 为模版进行扩增，所用引物由上海捷瑞生物工程有限公司并合成：

加样体系按照定量PCR 检测试剂盒说明进行操作，反应采用标准的两步法：95 ℃1 min，1 个循环；95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 个循环，采用溶解曲线是判断扩增产物是否单一，采用2-△△Ct法计算表达量的相对比值。

七、蛋白质免疫印迹（Western blot，WB）

使用裂解液裂解细胞，之后用BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，确保每个蛋白样品的上样量为30 μg，电泳采用10%的SDS-PAGE 凝胶， 然后使用硝酸纤维素膜转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h， 加入Cyclin D1 抗体（1：1000）、Cyclin D2（1：1000）、Cyclin D3（1：1000）、β-actin抗体（1：2000）4 ℃过夜，TBST 洗膜后加HRP 标记的二抗（1：5000）室温孵育，然后加显影液曝光。

八、数据统计

所有数据都采用SPSS 20.0 统计软件分析。 各组计量资料采用均数±标准差（x±s）表示。 两组定量数据的比较：若正态分布，采用two-tailed Student’s t-test 分析；若非正态分布，采用Mann-Whitney U 检验。P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

结 果

一、养精胶囊促进SSCs 增殖，促进细胞由G1 期向S 期转化

图1A 表明，0.01、0.1、1 mg/mL 浓度 的 养精 胶 囊在24、36、48 h 这三个时间点的增殖活性与空白对照组相比有统计学差 异（P＜0.05，P＜0.01）， 而10 mg/mL 的养精胶囊与空白对照组相比无统计学差异（P＞0.05）， 表明过高浓度的养精胶囊对于小鼠SSCs的增殖可能有抑制作用， 因此， 后续实验我们选用0.01、0.1、1 mg/mL 这三种浓度作为养精胶囊的低、中、高浓度进行。细胞周期结果（图1B、图1C）显示养精胶囊（1 mg/mL）和GDNF（20 ng/mL）作用细胞48 h 后，能通过影响小鼠SSCs 的G0/G1和S、G2/M 期而影响细胞周期。随着养精胶囊提取液浓度的升高，S 期细胞比例依次升高，高剂量养精胶囊组和GDNF 组与空白对照组相比， 分别是升高22.7%和34.5%， 有统计学意义（P＜0.01），表明养精胶囊提取液和GDNF 能提高小鼠SSCs 的合成。

图1 养精胶囊对SSCs 增殖活性、细胞周期的影响

二、养精胶囊促进cyclin D1 的表达

Cyclin D 有Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3 三个亚型，qRT-PCR 实验表明（图2A）， 养精胶囊（1 mg/mL）和GDNF（20 ng/mL）可以提高Cyclin D1 的转录水平，增加Cyclin D1 mRNA 的表达（P＜0.01），而对Cyclin D2、Cyclin D3 的转录水平无影响（P＞0.05）。 图2B-2D 表明养精胶囊和GDNF 可以增加Cyclin D1 蛋白的表达， 而对Cyclin D2、Cyclin D3 蛋白的表达无明显提高。

图2 养精胶囊对Cyclin D mRNA 和蛋白水平的影响

三、养精胶囊通过cyclinD1 促进SSCs 增殖

图3A 表明加入siRNA-Cyclin D1 预处理后再加入养精胶囊（1mg/mL）培养48 h，细胞的增殖活性与养精胶囊（1mg/mL）+siRNA-NC 组相比降低17.4%，有统计学差异（P＜0.01），表明siRNA-Cyclin D1 能够抑制小鼠SSCs 的增殖。 图3B 表明养精胶囊+siRNA-Cyclin D1组与养精胶囊+siRNA-NC 组相比S 期细胞比例减少21.3%，有统计学差异（P＜0.01）。 图3C、3D 表明养精胶囊+siRNA-Cyclin D1 组与养精胶囊+siRNA-NC 组相比Cyclin D1 mRNA 和蛋白的表达水平均降低。

四、养精胶囊通过PI3K-Akt 促进SSCs 增殖

图3 阻断Cyclin D1 后养精胶囊对SSCs 的影响

接下来采用PI3K 阻断剂LY294002 阻断PI3KAkt 通路，图4A 表明加入LY294002 预处理后再加入养精胶囊（1 mg/mL）培养48 h，细胞的增殖活性与养精胶囊组（1 mg/mL）相比降低9.9%，有统计学差异（P＜0.01），表明养精胶囊通过PI3K-Akt 通路促进SSCs 的增殖。 图4B 表明养精胶囊+LY294002 组与养精胶囊组相比S期细胞比例减少12.1%， 有统计学差异（P＜0.01）。 图4C、4D 表明，养精胶囊+LY294002 组与养精胶囊组相比Cyclin D1 mRNA 和蛋白的表达水平均降低。

图4 阻断PI3K-Akt 后养精胶囊对SSCs 的影响

讨 论

养精胶囊是东南大学附属中大医院金保方教授运用中医学“肾藏精”的理论，以补肾填精、益气活血为治法创立的经验方，由淫羊藿、熟地、黄精、紫河车、沙苑子、煅牡蛎、黄芪、当归、荔枝核、王不留行、炙水蛭共11味中药组成。 方中淫羊藿味辛甘性温，走肝肾二经，为补命门、益精气之要药，熟地味甘性微温，亦归肝肾二经，有补血养阴、填精益髓之功，九蒸九晒熟地为补血之首剂，淫羊藿配熟地，阴阳互根互用，增强疗效。 紫河车乃血肉有情之品，扶正固本，养血益精，黄芪-黄精为补气养阴固精的常用药对，气阴双补，使得阳有所依。沙苑子、煅牡蛎其性下行，补肾固精，煅牡蛎还含有精子生长所必须的锌、硒等微量元素。 荔枝核、当归、炙水蛭、王不留行共奏行气活血之功，使得药物补而不滞，滋而不腻。 方中除了传统补肾填精之药，还添加了行气活血之药， 既能补肾入精室， 又能行气活血以养精生精。 这种补肾填精与行气活血药物的配合，可改善睾丸和附属性腺的内环境，促进精子发生，提高临床疗效。

前期实验研究表明，养精胶囊可以通过多途径、多靶点改善睾丸的生精功能，通过VEGFA/eNOS 通路作用于睾丸的微循环，改善血管内皮功能，促进血管的修复和新生[9,10]；通过Nur77/StAR 通路作用于睾丸间质细胞，促进睾酮的合成，改善SSCs 生长的微环境，间接促进精子发生[11-13]；还可以直接作用于SSCs，与GDNF 受体GFRα1 结合，通过PI3K-Akt 通路，促进SSCs 的增殖[7]，但PI3K-Akt 通路下游的机制不清，还需进一步探索。 而Cyclin D 是PI3K-Akt 通路下游重要的调节蛋白，在SSCs 周期的调控中扮演着重要的角色，Cyclin D作为细胞周期的启动因子，作用于G1 期，促进G1/S 期的过渡，进而促进SSCs 的增殖[14]。 本研究发现养精胶囊可以促进SSCs 的增殖、提高S 期细胞的比例（图1），并且提高Cyclin D1 mRNA 和蛋白水平的表达， 但对Cyclin D2、Cyclin D3 的表达无影响（图2）。 接下来运用siRNA-Cyclin D1 阻断Cyclin D1 的表达，发现阻断Cyclin D1 之后，SSCs 的增殖活性降低、S 期细胞比例减少，同时伴随着Cyclin D1 的表达降低（图3）。 最后， 运用PI3K 阻断剂LY294002 进行阻断PI3K-Ak 通路，发现阻断之后同样出现SSCs 的增殖活性降低、S 期细胞比例减少、以及p-Akt/Akt 和Cyclin D1 的表达降低（图4）。

综上， 补肾填精中药养精胶囊可以通过PI3K-Akt通路作用于Cyclin D1，进而促进SSCs 增殖。 这对于阐明补肾填精法改善男性生殖功能的作用靶点，揭示“肾藏精”的科学内涵，进而指导临床运用中药治疗少弱精症导致的男性不育， 提高男性的生殖健康和生活质量均具有重要的理论意义和临床价值。