重度少精子症伴高碎片化精液精子和睾丸精子行ICSI 助孕后临床结局分析

张明亮 郑小挺 薛 洁 马 玲 姚文亮 熊 奇 陈胜辉

南昌市生殖医院，江西中医药大学附属生殖医院（江西南昌 330000）

随着社会经济的快速发展， 在众多因素的影响下，不孕不育的发病率呈逐年上升的趋势， 而根据有关报道发现，因男方因素引起的不孕不育约占一半[1]。 在过去，诊断男性不育症主要依赖精子浓度、活动率及精子形态学分析等参数，因其相应诊断存在一定的局限性，临床接诊过程中仍有一部分不育患者难以确定不育原因， 普通的精液相关检测无法反映男性生育力的真实水平。 因此，需要一个新的评估男性生育力指标。 随着精子DNA 碎片检测的出现， 精子DNA 结构的损伤引起男性不育受到生殖界的关注。有学者提出DNA 结构高度完整的精子对于成功受精和维持正常的胚胎发育是必需的[2]。精子自身没有DNA 修复机制，而染色质结构的完整性是正常受精、胚胎发育与妊娠的前提条件[3，4]。研究报道，精子DNA 损伤是精子染色质结构异常的一个重要特征，是造成男性不育、受精率、优质胚胎率、复发性自然流产以及ART 治疗失败的重要原因之一[5，6]。重度少精子症患者往往选择卵泡浆内单精子注射（ICSI）助孕治疗，学者认为伴有高DNA 碎片化（DNA fragmentation index，DFI）可能会对患者助孕的临床结局有一定的影响， 同时也增加了携带有缺陷的基因的精子进行受孕的机会， 高DFI 精子直接注射到卵细胞的胞浆内，导致受精率、胚胎率及流产率等影响。 基于上述理论，重度少、弱精子伴有高DFI 患者选择精子的方式是临床上关注的重点，本研究拟观察重度少、弱精子伴有高DFI 患者精液精子和睾丸精子行ICSI 助孕后临床结局的比较，探讨一种临床结局较好的取精方式。

讨 论

一、研究对象

选取南昌市附属生殖医院生殖男科门诊2017 年4月至2018 年4 月行ICSI 助孕治疗的82 例患者， 其中有3 例患者因各种因素取消移植， 本研究纳入标准：1）患者属于重度少精子症（＜500 万/mL， 世界卫生组织《WHO 人类精液检查与处理实验室手册》第五版）同时伴有精子DNA 碎片异常（DFI＞15%）；2）女方单纯输卵管因素，生育力评估基本正常，卵巢功能、宫腔环境良好及无免疫性疾病；3）男女双方染色体正常，男性无外伤、无遗传史，无性功能障碍及生殖系统感染等。

二、研究方法

（一）分组情况

将82 例患者按随机分组法分为睾丸精子组42例： 在女方取卵当日男方行睾丸显微取精术（Microtesticular sperm extraction，M-TESE）， 将获取的适量精子行ICSI 助孕；精液精子组40 例：在女方取卵当日，男方在禁欲7 天内行手淫取出新鲜精液送实验室处理后行ICSI 助孕； 两组患者取精前和取精后分别检测其精子DNA 碎片情况。

（二）精子、卵子标本

1. 精子标本：睾丸组精子获取实行显微取精术：全麻后在显微镜下沿着睾丸赤道线切开睾丸白膜， 暴露出曲细精管， 在高倍显微镜下选取较为饱满粗大发亮的曲细精管，滴入适量的培养液，立即送往实验室，由实验室工作人员撕开曲细精管后， 在倒置的显微镜下发现适量活动的精子备用； 精液组精子在禁欲7 天内由患者手淫获取新鲜精液送实验室检测处理备用；

2. 卵子标本： 纳入标准的女方均采用改良超长方案促排卵， 在月经周期第二天皮下注射醋酸亮丙瑞林微球(贝依)3.75mg，注射日开始计算，35 天后返院予以静脉注射尿促卵泡素150～300IU 和尿促性腺激素75～150IU， 超声发现当有1 个卵泡直径≥1.8cm 或2 个卵泡平均直径≥1.7mm 时停止用药，当晚21 点肌注绒促性腺激素8000 单位，36～38h 后在阴道B 超引导下行取卵术，并记录取卵情况和获卵数。

（三）DFI 检测

两组患者嘱咐禁欲7 天内进行取精， 流式细胞仪检测DFI， 其中试剂盒购自浙江星博生物科技有限公司。 严格按照试剂说明标准化操作，在高倍显微镜下观察500 个精子，记录存在DNA 碎片精子的个数。 精子是否存在DNA 碎片的标准:精子头部仅产生较小光晕或无光晕， 单侧光晕厚度不超过精子头部最小直径的1/3。 计算DFI（%）=存在DNA 碎片精子数/ 被观察精子的总数×100%。

（四）ICSI 获取精子和取卵后， 在倒置显微镜下利用显微注射针将精子注射到卵泡浆内， 观察受精和评估胚胎情况。

（五）胚胎移植 所有受试患者均采取3 日龄卵裂胚移植，观察移植后情况。

（六）临床结局 记录卵裂胚移植后12d，行血绒毛膜促性腺激素（human choionic gonadotophin，HCG）检查，阳性者为生化妊娠，移植后5 周行B 超检测，宫内可见孕囊、胚芽及胎心者确诊为临床妊娠。

（七）观察指标

1.睾丸组M-TESE 后精子DNA 碎片变化情况；

2.两组精子ICSI 后受精率、优质胚胎率、可用胚胎数、流产率和抱婴率情况。

（八）统计学分析

两组患者所涉及的数据均采用SPSS17.0 软件统计分析，其中计数资料采用卡方检验；计量资料符合正态分布采用均数±标准差（x±s），并采用两组独立样本t检验计算，P值大于0.05 被认为无统计学意义，反之具有明显差异，有统计学意义。

结 果

一、试验基本情况

本次试验共有82 例受试患者纳入，在睾丸组和精液组的所有受试患者中， 试验周期内患者因个人原因或其他原因未移植的，睾丸组2 例，精液组1 例，共3例患者， 均作剔除处理， 完成整个试验的， 治疗组40例、对照组39 例。

二、两组受试患者基本情况比较

其中两组患者的年龄、不育年限、精子浓度及精子碎片情况比较无统计学差异，（P＞0.05），见表1。

表1 两组基本情况对比

三、睾丸精子组患者睾丸取精前后精子碎片情况比较

其中睾丸获取精子后再次检测碎片发现精子碎片率明显低于精液组精子， 对照组精液精子和治疗组睾丸精子DFI 分别为27.55±4.78 和6.70±1.98，（P＜0.01）比较具有统计学差异；

四、两组患者ICSI 助孕后临床结局对比，见表2。

表2 两组患者受精和胚胎情况对比

五、两组患者ICSI 助孕后临床结局对比，见表3。

表3 两组患者临床结局对比

讨 论

DFI 作为评估男性生育力的新指标在ART 助孕中有着重要的指导意义，为男性不育的诊疗开拓了新的思路。 国内外有研究表明DFI 与精液常规质量、精子形态学等存在相关性[7-9]，也有研究认为DFI＞30%影响不育及妊娠率， 当DFI＞30%时ICSI 助孕可能是首选的助孕方法[10，11]。相关研究发现精子DFI 增高导致ICSI 助孕的生化妊娠率及流产率增高， 而对临床妊娠率无明显影响，而高DFI 精子行ICSI 助孕与体外受精（In Vitro Fertilization，IVF）助孕相比较，其临床妊娠率和种植率明显高于后者，有统计学差异，对于高DFI 患者ICSI 可作为一种较好的助孕选择方式[12，13]。 柳祖波等[14]研究报道探讨725 例不孕夫妇病例中， 发现精子DNA 碎片对IVF结局基本无影响， 但与ICSI 结局中的可用胚胎率和优质胚胎率呈负相关，并认为这可能与受精过程中IVF 周期中卵子对精子有自然选择的过程， 而ICSI 周期中则是与人为的选择精子有关。 也有Carlini T 等[15]针对意大利反复流产的夫妇研究中评估DFI 发现，男性精液DFI水平与不育组相似，高于正常生育组，但其认为不能以单纯的DFI 作为反复流产风险的预测指标。 Oleszczuk K 等[16]研究认为当DFI 值＞40%以上，流产率会明显上升， 其检测可作为选择ART 受精方式方法， 高碎片精子，选择ICSI 可能会是更好的方法。 但上述结论尚未得到统一，目前的男性不育及ART 诊疗共识中，尚未纳入适应证范围内，目前仍未得到国际上一致认可的结论。

而在少精子症伴有高DFI 患者中， 有研究观察发现其睾丸内获取的精子DFI 明显低于射出精子， 研究中经末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP 镍端标记(TUNEL)法检测的DFI 在射精时显著高于睾丸精子，有统计学差异， 认为睾丸内精子受到外界的损伤程度较小，也有研究认为睾丸精子提取和ICSI 在高DFI 不育男性中具有协同作用， 睾丸精子注射ICSI 助孕后怀孕率明显高于射精后ICSI 助孕[17，18]。而Ben-AmiI 等[19]研究17 例隐匿性精子症伴有高碎片的患者中，结果发现使用睾丸精子的分娩率明显高于精液精子。 虽然在高DFI 患者中，有观察发现使用ICSI 助孕比使用IVF 助孕后更容易受孕， 这可能与治疗的人群和每种方法中使用精子处理技术的不同有关[20]。 有报道涉及2,969 对夫妇的荟萃分析中发现，当DFI比例异常高的精液样本被用于ICSI 时， 流产的风险增加了2.16 倍[21]。 这与我们的研究中的情况一致，结合本次研究数据中发现，也验证了上述学者们的观点，少精子症伴有高DFI 患者中的睾丸获取精子的DFI 明显低于精液精子，而行ICSI 助孕后受精率对比无差异，但胚胎质量和临床结局等情况具有明显差异。 数据显示，精液精子组有较高的流产率，睾丸精子有较好的临床结局。

有Ollero M,Alvarez JG 等学者[22，23]认为DNA 损伤主要是睾丸后发生的事件，DNA 结构的损伤可以在睾丸精子中发现，是因为直接减数分裂失败或早期染色质缺陷装配， 但绝大多数的DNA 损伤是在射精中观察到的。 故而验证了睾丸精子的DFI 要明显低于精液精子。然而，随着显微外科的发展，在以往的非梗阻性无精子症（non-obstructive azoospermia，NOA） 患 者 中 通 过M-TESE 获取的精子行ICSI 助孕后产下的新生儿是安全可靠的，但这些数据仅涉及NOA 患者的收集，而在少精子症伴有高DFI 患者中使用睾丸精子助孕需要持续的监测，直到该选择精子方法的安全可靠性得到认可。

综上所述，本次研究的结果表明，对重度少精子症伴有高DFI 患者， 选择睾丸精子助孕具有较好的临床结局， 为临床上高DFI 患者选择ART 助孕技术以外，提供一种更为安全可靠的精子选择方式。