香叶提取物抗氧化及抗疲劳研究

王少娟，王志英

(1.河南水利与环境职业学院，郑州 450008；2.黄河科技学院，郑州 450063)

1 概述

香叶是天竺葵的茎和叶，在我国被广泛栽培，具有特殊的芳香气味，其主要成分包括香叶醇、香茅醇和芳樟醇等[1-2]。香叶作为调味剂在日常生活中被广泛运用，也被医疗行业用于祛风、祛湿和止痛[3]。香叶中除了含有芳香挥发油之外，还含有丰富的黄酮和多糖类成分，而黄酮具有抗氧化、抗疲劳、消炎、降血压和提高机体免疫力等多种生物学功能。

近年来也发现香叶精油提取物对动物肿瘤细胞具有明显的疗效。通过对体外癌细胞抑制生长的实验，发现香叶提取物具有明显的抑制癌细胞生长的效果，拥有作为抗癌新药开发的潜力。2015年，段宙位等[4]报道香叶油对宫颈癌具有较好的疗效；2016年，潘军辉等[5]也指出香叶油对宫颈癌有较好的疗效。此外，香叶在抑制细菌和真菌生长方面也具有很好的疗效，对致病性和非致病性细菌具有广谱杀菌和抑菌作用[6-7]。

2 实验材料和方法

2.1 实验材料

香叶干浸膏、维生素C、DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基、超氧阴离子、邻苯三酚、盐酸、磷酸、蒸馏水、过氧化氢、硫酸铁、水杨酸乙醇、亚硫酸钾、芦丁、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、无水乙醇、纤维素酶。

2.2 实验仪器

分光光度计、恒温水浴锅、分析天平、真空泵、烘箱、离心机、紫外分光光度计。

2.3 实验方法

2.3.1 DPPH自由基清除实验

称取适量的香叶干浸膏，用浓度为50%的无水乙醇制备浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL 5种质量分数的溶液，将5种质量分数的溶液分别取2 mL加入到5个比色管中，再加入0.2 mmol/L的DPPH·溶液2 mL，摇匀，放置0.5 h，在517 nm处测定吸光度值为A样品。在5个比色管中加入上述5种浓度的香叶，然后加入无水乙醇2 mL，摇匀，放置0.5 h，在517 nm处测定吸光度值为A对照。其他条件不变，将香叶溶液变为蒸馏水，测定的吸光度值为A空白。称取适量的维生素，按照上述方法，获得维生素C的吸光度值。通过下式计算香叶样品溶液和维生素C的DPPH·清除率[8-9]。

DPPH·清除率(%)=[(A空白-A样品+A对照)/A空白]×100。

2.3.2 ABTS自由基清除实验

将ABTS制成7 mol/L的溶液，亚硫酸钾制成4.8 mol/L的溶液，二者进行等体积的混合，将溶液放置于室内避光12 h，制成实验所用的ABTS自由基溶液[10-11]。将ABTS自由基溶液制成吸光度值为0.600±0.01的工作液加入6支不同的比色管中，在2组6支ABTS自由基溶液中分别添加浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL 5种质量分数的香叶提取物和维生素C溶液，摇匀，在室温条件下放置6 min，在波长为734 nm的条件下测定吸光度值，通过下式计算ABTS自由基的清除率[12]。

ABTS自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

式中：A1为加入不同浓度的香叶提取物的吸光度值，A2为等体积的蒸馏水代替ABTS自由基的吸光度值，A0为等体积的样品蒸馏水代替样品的吸光度值。

2.3.3 羟自由基清除实验

配制浓度为9 mol/L的硫酸铁和水杨酸乙醇溶液和8.8 mol/L的过氧化氢。准备浓度为5，10，15，20 mg/mL的香叶提取物和醋酸[13]。按照硫酸铁、水杨酸乙醇溶液和过氧化氢溶液的顺序分别添加1 mL溶液，在室温条件下放置1 h，在510 nm处测定吸光度。对羟自由基的清除率见下式。

羟自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

式中：A1为加入不同浓度的香叶提取物的吸光度值，A2为等体积的蒸馏水代替过氧化氢的吸光度值，A0为等体积的样品蒸馏水代替样品的吸光度值。

2.3.4 超氧阴离子清除实验

取浓度为0.1 mol/L的磷酸缓冲溶液3.5 mL，添加1 mL蒸馏水，最后加入0.5 mL浓度为10 mol/L的邻苯三酚溶液，摇匀，1 min后在波长为325 nm处测定吸光度A1，之后隔1 min记录一次A2数据一直记录到5 min，阴离子清除率稳定，使用浓度为10 mol/L的盐酸作为邻苯三酚溶液的空白对照来计算邻苯三酚的自氧化速率(S1)[14-16]。分别使用浓度为5，10，15，20 mg/mL的香叶提取物和醋酸溶液，按照上面的操作方法，测定实验后的溶液吸光度，同时计算加样后的邻苯三酚自氧化速率[17-18]。

S0=(A2-A1)/3,

超氧阴离子清除率(%)=[(S0-S1)/S0]×100。

式中：S0为邻苯三酚自氧化速率，A2为第5 min时的吸光度值，A1为第1 min时的吸光度值，S1为加入香叶提取物后的自氧化速率。

3 香叶提取物抗氧化活性研究

3.1 DPPH自由基清除率

图1 维生素C和香叶提取物对DPPH·的清除率Fig.1 The scavenging rate of vitamin C and Geranium extract on DPPH·free radicals

由图1可知，随着维生素C和香叶提取物溶液质量的增加，DPPH·的清除率均逐渐升高，维生素C和香叶提取物对DPPH·的清除率均与二者的溶液质量浓度呈现正相关。当溶液质量浓度低于0.5 mg/mL时，维生素C的DPPH·清除率均高于香叶提取物的DPPH·清除率；当溶液浓度大于0.5 mg/mL时，香叶提取物与维生素C的清除率相接近。香叶提取物对DPPH·的清除率与质量浓度的回归方程为Y=3.0245+269.2346X，R2=0.8902，香叶提取物的清除率IC50值为(1.12±0.02) mg/mL；维生素C的质量浓度对DPPH·清除率的线性回归方程为Y=22.2334+187.2365X，R2=0.9961，其IC50值为0.1501 mg/mL。

3.2 ABTS自由基清除率

图2 维生素C和香叶提取物对ABTS自由基的清除率Fig.2 The scavenging rate of vitamin C and Geranium extract on ABTS free radicals

ABTS自由基能够很好地溶解于水中，经常被用于测定一些天然产物的抗氧化活性，主要是测定抗氧化剂保持氧化还原的能力。通过使用不同浓度的香叶提取物和维生素C，利用ABTS自由基清除能力的大小来测定香叶提取物和维生素C的抗氧化活性。由图2可知，香叶提取物浓度低于20 mg/mL时，维生素C的抗氧化活性高于香叶提取物的抗氧化活性，当香叶提取物浓度高于20 mg/mL时，维生素C与香叶提取物的ABTS清除率接近100%。

3.3 羟自由基清除率

图3 香叶提取物和醋酸对羟自由基的清除率Fig.3 The scavenging rate of Geranium extract and acetic acid on hydroxyl free radicals

羟自由基是目前在生物机体中已知的一种对生物体毒性最强的氧自由基，在生物体内，能氧化生物体中的多种分子，引起机体细胞衰老和死亡，氨基酸、蛋白质、脂质和核酸等多种物质发生氧化损伤，从而引发机体功能紊乱。由图3可知，香叶提取物对羟自由基的清除能力一直高于醋酸对羟自由基的清除能力。香叶提取物与醋酸对羟自由基的清除能力随着二者浓度的增高而提高。

3.4 超氧阴离子清除率

图4 香叶提取物和醋酸对超氧阴离子的清除率Fig.4 The scavenging rate of Geranium extract and acetic acid on superoxide anions

超氧阴离子是人机体内一种特殊的自由基，人机体内存在的数量少，在不接触羟基时，对机体不能产生损伤，但是与机体接触后的产物对机体细胞具有较强的氧化毒害作用，除此之外，超氧阴离子还与人类多种疾病发生有关。所以，超氧阴离子的测定也是香叶提取物抗氧化活性测定的重要指标。由图4可知，香叶提取物与醋酸溶液二者对超氧阴离子均存在一定的清除率，且在相同浓度下，香叶提取物对超氧阴离子的清除率高于醋酸溶液的清除率。

4 香叶提取物抗疲劳作用研究

运动耐力下降是疲劳的最直接体现，小鼠负重游泳时间是反映运动耐力的重要指标，通过对不同浓度的香叶提取物和空白对照小鼠负重游泳时间影响的研究，发现不同浓度的香叶提取物都能提高小鼠负重游泳时间，与空白对照相比较，10 mg/mL的香叶提取物小鼠负重游泳时间提高了47.5%；20 mg/mL提高了69.3%；30 mg/mL提高了118.7%。研究结果显示，高浓度的香叶提取物能够提高小鼠的运动耐力。

小鼠长期的激烈运动，肌肉在缺氧的状态下，发生糖酵解反应，产生大量的乳酸，肌肉的乳酸堆积是疲劳产生的主要原因，激烈运动之后BLA被清除的速度越快，则抗疲劳效果越好。不同剂量的香叶提取物浓度对运动后的小鼠的BLA都有一定的抑制作用。游泳前在安静的状态下，香叶提取物对BLA含量无明显影响。与空白对照组比较，30 mg/mL香叶提取物饲喂的小鼠BLA含量在运动后的0 min和20 min分别降低了7.8%和6.8%。

5 结论

通过研究发现，香叶提取物具有很好的抗氧化和抗疲劳作用；抗氧化作用是通过清除机体的DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基和超氧阴离子而实现抗氧化的功能。无论是机体的自由基还是超氧阴离子，清除率均与香叶提取物浓度呈现正相关，该研究结果与前人的研究结果相似[19-21]。当香叶提取物浓度低于0.5 mg/mL时，香叶提取物对DPPH自由基的清除率低于维生素C的清除率；当香叶提取物浓度高于0.5 mg/mL时，香叶提取物对DPPH自由基的清除率比维生素C对DPPH自由基的清除率高。当香叶提取物浓度低于20 mg/mL时，维生素C的抗氧化活性高于香叶提取物的抗氧化活性；当香叶提取物浓度高于20 mg/mL时，维生素C与香叶提取物的ABTS自由基清除率接近100%。香叶提取物对羟自由基的清除能力一直高于醋酸对羟自由基的清除能力，香叶提取物与醋酸对羟自由基的清除能力一直随着二者浓度的增高而提高。香叶提取物与醋酸溶液二者对超氧阴离子均存在一定的清除率，随着香叶提取物和醋酸溶液浓度的提升，二者对超氧阴离子的清除均呈现上升趋势，且在相同浓度下，香叶提取物对超氧阴离子的清除率高于醋酸溶液的清除率。相比较维生素C和醋酸，香叶提取物拥有较好的抗氧化活性[22-23]。

近年来，抗疲劳和抗氧化活性研究的食品越来越多，例如辣椒素、陈醋、花椒、百里香和生姜等[24-28]，同时香叶的抗氧化活性研究也成为研究重点。香叶提取物的抗疲劳作用是通过对机体多糖成分中自由基的清除来实现的。当运动强度提高，活动量增大时，由于自由基作用而引起的脂质过氧化反应，导致生物体细胞器受到损伤，引起细胞代谢的混乱和病理变化，肌肉不能实现正常的功能，从而产生疲劳[29-30]。除此之外，运动强度增强时，肌肉中的ATP含量会下降，经过10 s左右，机体中的葡萄糖能够通过无氧酵解提供给机体能量。当机体中血糖浓度低时，血糖能量供应不足，产生疲劳。在实验中发现，含有多糖和黄酮类成分的香叶能增强机体肝糖原的储备，从而产生抗疲劳的效果。