PCR-DGGE法分析泡菜中酵母菌微生物的多样性

燕平梅，李安萍

(1.太原师范学院 生物系，太原 030619; 2.土壤消毒活化绿色产业技术 创新战略联盟，太原 030619)

我国是一个蔬菜生产大国，蔬菜资源丰富。从古至今，蔬菜都是人类赖以生存的食物，在旺季时，会有源源不断的各种新鲜蔬菜生产，但是我国目前蔬菜的产后加工水平相对比较落后，因此，市场供过于求，大量新鲜蔬菜积压变质的情况经常发生，这不仅造成蔬菜的严重浪费，还会使农民种植蔬菜的积极性严重降低。然而，这个棘手的问题可以通过将一部分新鲜蔬菜腌制发酵成泡菜这一方法得到缓解。

泡菜的主要原料是各种蔬菜，一般来说，只要是纤维丰富的蔬菜或水果，都可以被制成泡菜，泡菜中富含维生素及钙、铁、磷、蛋白质等物质。泡菜中含有乳酸，有助于食物的消化吸收，吃泡菜可以增加肠胃中有益的菌，抑制肠道中的致病菌，有防止便秘、增强身体的抵抗力、降低胆固醇等作用[1]。与新鲜蔬菜相比，泡菜具有更加独特的风味，我国已形成具有地方特色的泡菜，如四川泡菜等。酵母菌对泡菜独特的风味和质地以及储藏有着重要的影响[2]，在利用可发酵糖方面起有益的作用，但如果对其发酵不加以控制，酵母菌的产醇增加会有损泡菜的风味，降低泡菜的口感。泡菜发酵时的酵母菌不仅有产醇能力，还有产气能力、产酸能力和产香能力[3]。酵母菌的产气能力能使泡菜的质地疏松，但如果产气过多会使泡菜易膨胀；产酸能力可以改变泡菜的酸度和风味，产酸过多会影响泡菜的风味；产香能力也对泡菜的风味极其重要。燕平梅等[4]研究发现，辣椒、花椒、生姜、大蒜对部分酵母菌会产生抑制作用，因此，可以加入一些辣椒等调料对酵母菌进行适当抑制。虽然我国的泡菜有了很大的发展，但若与韩国、日本的泡菜产业相比，我国的泡菜发展还是比较滞后的[5]。

1999年，Ampe等[6]首次将DGGE技术运用于食品菌群结构的研究，随后许多科学家将这一技术运用到泡菜等发酵食品微生物多样性的研究中[7]。燕平梅等[8]研究表明PCR-DGGE法可用于发酵食品如泡菜中微生物系统的研究。尹礼国等[9]用DGGE法分析盐渍青菜中的真菌，以及分离鉴定青菜中的酵母菌。张先琴等[10]、张鹏[11]采用PCR-DGGE法研究了四川泡菜中细菌和真菌的多样性。2008年，Chang Ho-Won等[12]用DGGE法对泡菜中的细菌、古菌和真菌进行了研究。刘鹏飞等[13]研究发现，DGGE法是不依赖于微生物的分离培养便能研究微生物中多样性的工具之一，它具有检测极低、有助于发现新物种[14]、分析速度快及重复性好等优点。非培养法较培养法而言，具有快速、准确、灵敏等优点[15]。本实验采用非培养法直接提取3种不同泡菜中的总DNA，通过PCR-DGGE方法研究泡菜中酵母菌微生物的多样性。

1 材料与方法

1.1 材料

散称泡菜250 g(原料：甘蓝)，用P1表示；白菜泡菜175 g(原料：白菜)，用P2表示；泡酸菜(原料：芥菜)，用P3表示。

1.2 试剂与仪器

DNA提取试剂盒(离心柱型)：天跟时代公司；PCR Master Mix、NL1-GC、丙烯酰胺/甲叉、过硫酸铵、去离子甲酰胺。

WFH-202B型紫外透色分析仪、DcodeTM凝胶成像系统、Bio-Rad电泳仪 美国Bio-Rad公司；摇床。

1.3 实验方法

1.3.1 泡菜汁中总DNA的提取

在超净工作台中用滤纸(已灭菌)过滤泡菜汁到16个2 mL离心管(已灭菌)中，以8000 r/min离心5 min，倒尽上清液，聚集沉淀，再次离心5 min，倒掉上清液，然后按照离心柱型DNA提取试剂盒说明书提取总DNA，于-20 ℃保存。用1%的琼脂糖凝胶检测DNA。

1.3.2 酵母菌DNA片段PCR扩增

在引物合成公司合成酵母菌上引物和下引物，分别为NL1-GC(cgc ccg ccg cgc ggc ggg cgg ggc ggg ggc gcg ata tca ata agc gga gga aaa g)，LS2(att ccc aaa caa ctc gac tc)[16]。PCR反应程序：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，46 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，30个循环。

1.3.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

变性梯度凝胶的变性剂浓度为35%～60%，电泳后凝胶采用Bio-Rad公司的凝胶成像系统分析、拍照。将每条可看到的电泳带切割回收，溶胶后作为模板通过PCR反应扩增26S rDNA 片段，纯化后与pGM-T Vector进行连接， 转化感受态细胞。将检测阳性克隆的送到华大基因公司进行基因序列测定。

1.3.4 DGGE图谱多样性分析

所得图像用Bio-Rad Quantity One软件对DGGE图谱进行多样性分析，最后可以计算出其多样性指数(H)、均匀度指数(D)、丰富度指数(R)。

H=-∑(Pi)In(Pi)；D=1-∑(Pi)2；R=S-1/InN。

式中：S为某一泳道总条带数，N为某一泳道所有峰面积。

2 结果与分析

2.1 DNA的提取结果

总DNA提取后的电泳图见图1，从左到右依次是P1、P2、P3。DNA含量较少，但是纯度高，可以做PCR扩增。

图1 总DNA电泳图Fig.1 The electrophoretogram of total DNA

2.2 PCR扩增结果

酵母菌DNA片段PCR扩增产物的电泳图见图2，从左到右依次是Marker、P1、P2、P3，其大小在200～300 bp之间。

图2 PCR扩增产物电泳图Fig.2 The electrophoretogram of PCR amplified product

由图2可知，扩增产物条带清晰，且是目标条带，因此可以做DGGE。

2.3 DGGE结果分析

DGGE结果见图3。

图3 泡菜样品的DGGE电泳图Fig.3 The DGGE electrophoresis of pickle samples

根据变性梯度凝胶电泳的分离原理，图中P1-1、P2-1、P2-2、P2-3、P3-1、P3-2 6个条带，其中P1-1、P2-3、P3-2 3个条带处于同一高度，代表同一种酵母菌；P2-1和P3-1处于同一高度，也属于同一种酵母菌；P2-2代表1种酵母菌。由此可知，这3种泡菜中共有3种不同的酵母菌。将这些条带进行回收测序，并与标准核酸基因库进行比对，可鉴定DGGE图中这些条带所对应的酵母菌，从而分析出泡菜中酵母菌的种类。

2.4 对DGGE图谱进行多样性指数分析

利用Quantity One软件分析P1、P2、P3的多样性指数，结果见表1，得到的Relative Qty再除以100才为Pi值， 根据公式，计算多样性指数(H)、均匀度指数(D)、丰富度指数(R)。

表1 泡菜中微生物DGGE条带多样性分析Table 1 The diversity analysis of microbial DGGE bands in pickles

2.5 聚类分析

运用Quantity One软件对3种泡菜中真菌酵母菌种类进行相似性聚类分析，泡菜中酵母菌的DGGE指纹图谱聚类分析结果见图4。

图4 泡菜中酵母菌的DGGE指纹图谱聚类分析图Fig.4 The DGGE fingerprint cluster analysis of yeast in pickles

结果显示：3种泡菜聚为一类，说明酵母菌大致属于同一类群。P2和P3的相似度为74%，P1与P2、P3的相似度为64%。

2.6 回收DGGE条带的鉴定

为了研究泡菜中的微生物种类，实验中回收亮度强的电泳带，通过对回收序列进行测序，并与GenBank库序列对比鉴定。经鉴定,P2-2、P3-1、P1-1与Candidatropicalis，Pichiafermentans，Saturnisporamendoncae的相似度分别为95%、89%、95%,见表2。

表2 泡菜酵母菌DGGE条带序列结果Table 2 The sequence of DGGE bands of yeast in pickles

通过MEGA 6.0软件构建系统发育树,见图5。

图5 泡菜中酵母菌系统发育树Fig.5 The phylogenetic tree of yeast in pickles

由图5可知，P3-1、P2-2、P1-1的亲缘关系比较近，为76%，Candidatropicalis和Saturnisporamendoncae这两种酵母菌的亲缘关系为100%。

3 讨论

本实验采用非培养法直接采用PCR-DGGE技术鉴定分析泡菜中酵母菌的多样性，采用非培养法可以避免传统发酵技术的局限性，具有重复性好、成本低、鉴定快速稳定等优点。前人对泡菜中酵母菌的研究认为，泡菜中细菌种类较多，真菌种类较少，张鹏从泡菜中分离得到2株酵母菌；张先琴等对四川发酵泡菜中微生物的研究表明，四川泡菜中的真菌有热带假丝酵母、汉逊德巴利酵母、奥默柯达菌和一些非培养的真菌；尹礼国等研究表明，在盐渍青菜中分离出10种酵母菌，有4种优势菌与假丝酵母属(Candida)[17]、德巴氏酵母属(Debaryomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces) 的菌株相似；曾骏等[18]从四川泡菜中分离到1株毕赤酵母菌。本实验结果显示：这3种泡菜中共含有3种不同的酵母菌，分别是毕赤酵母菌(Pichiafermentans)、热带假丝酵母菌(Candidatropicalis)、Saturnisporamendoncae，这与前人的研究结果有很大的相同之处，也有少许不同之处。

目前，PCR-DGGE技术已被广泛运用到微生物分子生态系统的研究中，如土壤、海洋等[19]。该技术有快速、准确、易操作等优点，最大的优点是可以检测出许多不可培养的菌株，但是也有一定的局限性，如该技术在分析细菌基因表达水平、代谢特征及细菌数量等信息时尚有不足；再如DNA条带的共迁移现象。近年来，许多研究者将这一技术与其他方法结合起来进行研究，如可以和传统技术结合，或与杂交技术结合[20]。