乳酸菌和酵母菌的添加对低盐酱油品质的影响

张雁凌，张雁南，刘刚

(吉林工程技术师范学院 食品工程学院，长春 130052)

酱油是重要的调味品，由大豆、面粉、麸皮等原料经高温蒸煮变性和微生物发酵作用分解为小分子物质，并通过各种化学反应形成，酱油是酵母菌和细菌等微生物综合作用的产物，在发酵过程中产生的酶和代谢产物形成了酱油独特的色、香、味成分[1]。在酱油发酵过程中，添加乳酸菌和酵母菌可以产生小分子醇、酸、酯、醛和酚等风味物质，形成酱油的风味[2]。嗜盐四联球菌是酱油发酵过程中的主要乳酸菌，其产生的有机酸可与酵母产生的醇类进行酸-醇酯化反应，形成浓郁的酯香，有效改善酱油的品质[3]。鲁氏酵母广泛应用于酱油发酵中，其发酵产生的醇类物质能与有机酸反应形成酯类物质，具有较高的风味贡献能力[4-6]。

研究表明，食品中的高盐已经成为诱发高血压的主要原因之一，为此，有必要开发低盐酱油以迎合人们的健康需求。低盐酱油由于发酵过程中温度较高，不利于微生物的生长繁殖，因而产生的酱油风味不足[7-8]。本文在低盐酱油发酵工艺的基础上，添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏接合酵母A22进行发酵，分析比较低盐酱油添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏接合酵母A22前后理化指标、挥发性风味物质和生物胺的变化，为乳酸菌和酵母菌在改善低盐酱油的品质方面提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米曲霉、嗜盐四联球菌TS71、鲁氏接合酵母A22、甲醛、乙醇、重铬酸钾、葡萄糖、氢氧化钠、盐酸；Agilent 1200高效液相色谱仪、GC6890N-MSD5975气相色谱-质谱联用仪、PHS-25型pH计、HH-4数显恒温水浴锅、HP-INNOWAX毛细管柱。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌和酵母菌的添加及低盐酱油的发酵

将熟大豆、小麦面粉和大米淀粉按7∶1∶1的比例混合，接种0.2%的米曲霉，在30 ℃环境下培养2 d，随后加入12%的盐水混合制成酱醪。在酱醪中加入嗜盐四联球菌TS71和鲁氏接合酵母A22，在室温下发酵3个月，发酵前和发酵过程中每月取出500 mL酱醪，无菌分离后用以进行分析测试。发酵完成后，过滤、离心取上清液，在80 ℃水浴中加热20 min，分析酱油的物理化学性质，样品记录为LS-TA。采用同样的发酵和取样方法，以不添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏接合酵母A22制备的低盐酱油作为对照,样品记录为LS。

1.2.2 常规指标和生物胺的测定

低盐酱油中氨基酸态氮和总酸采用国标GB/T 18186-2000规定的方法测定，还原糖采用国标GB/T 5009.7-2008规定的方法测定，乙醇含量采用重铬酸钾比色法测定，总酯含量采用连续电位滴定法测定。生物胺浓度的测定采用高效液相色谱法。

1.2.3 挥发性风味物质的测定

采用GC-MS对低盐酱油中的挥发性风味物质进行测定。气相色谱条件：以He为载气，流速1 mL/min，30 mm×0.25 mm毛细管柱，起始温度40 ℃，保温5 min，然后以5 ℃/min的升温速率加热至200 ℃后保温15 min，再以10 ℃/min的升温速率加热至220 ℃后保温5 min；质谱条件：电子能量70 eV，电压350 V，电流200 μA，温度200 ℃，扫描范围30～350 amu。

2 结果与讨论

2.1 低盐酱油发酵过程中pH变化趋势分析

LS和LS-TA在发酵期间pH的变化趋势见图1。

图1 低盐酱油发酵过程中pH变化趋势Fig.1 Changes of pH during fermentation of low-salt soy sauce

由图1可知，添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22对低盐酱油发酵过程中的pH没有明显影响。酱醪发酵最初的pH值在6.7左右，发酵1个月后，由于碳水化合物发酵、氨基酸积累以及微生物细胞的自我分解，pH降低，继续发酵，pH略有上升，酱油发酵结束后的pH保持在4.7左右。

2.2 低盐酱油理化指标分析

添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22的低盐酱油发酵结束后，取样测定其氨基酸态氮、总酸、总酯、还原糖含量和酒精度，与未添加的低盐酱油进行对比，结果见表1。

表1 LS和LS-TA低盐酱油理化指标对比Table 1 Comparison of physiochemical indexes of LS and LS-TA low-salt soy sauce

由表1可知，低盐酱油添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22后，总酸、总酯含量和酒精度明显提高，分别由14.82 g/L，68.42 g/L，0.08%vol提高为18.91 g/L，81.66 g/L，1.89%vol，氨基酸态氮和还原糖含量无明显变化。添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22后产生的醇类、酯类和有机酸类等物质增加了酱油的风味，相比未添加乳酸菌和酵母菌的低盐酱油，香味更加浓郁，不良气味有所降低。

2.3 低盐酱油中的挥发性风味物质分析

表2 LS和LS-TA低盐酱油挥发性物质对比Table 2 Comparison of volatile flavor components of LS and LS-TA low-salt soy sauce

续 表

由表2可知，添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22后，低盐酱油的酸类、醇类、酯类、醛类、酚类等主要挥发性成分的种类和含量相比未作添加的低盐酱油明显不同，醇类和酯类物质在挥发性成分中的比例提高，酸类和醛类物质的比例降低。

2.3.1 酸类挥发性物质

未作添加的低盐酱油存在醋酸、丁酸、戊酸、4-甲基戊酸和苯甲酸5种酸类挥发性物质，添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22后，酱油中的酸类挥发性物质种类和含量均发生了变化，检测到7种酸类挥发性物质，新增了辛酸和癸酸，但酸类物质在挥发性成分中的占比相比未作添加时明显降低，由13.81%下降为5.05%，其中醋酸含量变化最为明显，由9.88%下降为3.27%，酸类物质含量降低表明在发酵过程中，酸类物质与酵母代谢产物发生了反应，挥发性酸类物质总量降低，使低盐酱油的风味更为柔和[9-10]。

2.3.2 醇类挥发性物质

未作添加的低盐酱油中检测出7种醇类挥发性物质，分别为异戊醇、苯乙醇、糠醇、异辛醇、4-甲基-1-戊醇、1-辛烯-3-醇、3-甲硫基-1-丙醇，添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22后，总共的醇类挥发性物质仍为7种，新检测出苯甲醇，未检测出原有的异辛醇。添加乳酸菌和酵母菌后，低盐酱油中醇类挥发性物质占比由44.16%增加到59.22%，醇类物质总含量明显提高，其中苯乙醇含量由之前的2.14%增加为9.78%，3-甲硫基-1-丙醇由0.48%增加为0.69%。苯乙醇和3-甲硫基-1-丙醇是对低盐酱油香味贡献最大的两种特征香气，苯乙醇是由乙醇发酵时苯丙氨酸降解产生的，具有丁香、茴香、紫罗兰等独特香味，3-甲硫基-1-丙醇具有肉汤香味，在较低浓度时即有浓烈的香味。

2.3.3 醛类挥发性物质

醛类挥发性物质通常不是酱油的特征风味成分，但是醛类物质可以与酱油中的硫化物和醇类物质反应，提高酱油的风味。未作添加的低盐酱油中检测出6种醛类挥发性物质，分别为糠醛、苯甲醛、壬醛、苯乙醛、茴香醛和α-亚乙基-苯乙醛，添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22后，低盐酱油中新增了肉桂醛。添加乳酸菌和酵母菌后，醛类物质在总的挥发性物质中占比由10.71%降低为6.42%。

2.3.4 酯类挥发性物质

未作添加的低盐酱油中检测出4种酯类挥发性物质，分别为乳酸乙酯、醋酸苯乙酯、甲烷硫代磺酸-S-甲酯和邻苯二甲酸二异丁酯，添加乳酸菌和酵母菌后，除以上4种酯类挥发性物质外，还新增了苯乙酸乙酯和乙酸异戊酯两种酯类物质。添加乳酸菌和酵母菌后，酯类挥发性物质占比由1.31%增加至12.65%，除新增酯类物质外，原有的酯类物质百分含量也显著增加。未作添加时，低盐酱油中未检测到乙酸异戊酯，添加乳酸菌和酵母菌后，乙酸异戊酯含量增加为6.27%，醋酸苯乙酯含量从0.48%增加为5.86%。乙酸异戊酸和醋酸苯乙酯均具有新鲜果香味，提升这两种物质的含量有利于改善酱油的风味。酯类挥发性物质含量的提高可以归因于有机酸类与醇类的酯化作用，这种酯化作用主要由酵母发酵过程中产生的酯化酶引起。

2.3.5 其他挥发性物质

添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22后，低盐酱油中其他挥发性物质的含量也发生变化，如愈创木酚等酚类化合物、呋喃等含氧杂环化合物、吡嗪等含氮化合物。相比未作添加的低盐酱油，添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22后，低盐酱油中的这些化合物的含量有所降低，但是由于这些挥发性物质的风味阈值非常低，含量的降低并没有明显影响酱油的香味。

2.4 低盐酱油中的生物胺分析

生物胺广泛存在于发酵食品中，正常浓度的生物胺有利于维持细胞正常的生理功能，但当人体摄入生物胺浓度过高时，可能导致恶心、呼吸紊乱等过敏反应，因此，控制低盐酱油的生物胺含量尤为重要。通常要求酱油中生物胺的总含量不超过50 mg/kg，组胺含量不超过25 mg/kg。添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22的低盐酱油与未作添加的低盐酱油生物胺含量对比见表3，包括尸胺、腐胺、组胺和酪胺。添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22后，低盐酱油中的尸胺、组胺含量由14.82 mg/kg和12.43 mg/kg分别增加到18.91 mg/kg和13.67 mg/kg，腐胺含量由11.29 mg/kg降低为4.12 mg/kg，酪胺含量由1.76 mg/kg降低为0.18 mg/kg，生物胺的总含量由40.3 mg/kg降低为36.88 mg/kg。添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22的低盐酱油的组胺含量和生物胺的总含量均满足要求。

表3 LS和LS-TA低盐酱油生物胺浓度对比Table 3 Comparison of bioamines concentration of LS and LS-TA low-salt soy sauce mg/kg

3 结论

相比未作添加的低盐酱油，添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22后发酵过程中pH变化趋势不变，总酸、总酯含量和酒精度分别由14.82 g/L，68.42 g/L，0.08%vol提高为18.91 g/L，81.66 g/L，1.89%vol，氨基酸态氮和还原糖基本保持不变。挥发性风味成分分析表明，醇类和酯类挥发性物质占比升高，由原来的44.16%和1.31%分别提高至59.22%和12.65%，醛类和酸类挥发性物质占比降低，由原来的10.71%和13.81%分别降低至6.42%和5.05%。添加嗜盐四联球菌TS71和鲁氏酵母A22后，低盐酱油的生物胺由40.3 mg/kg降低为36.88 mg/kg。