我国25-羟基维生素D检测方法及其研究进展

潘晓芳 吴静标 黄燕虹 朱秀霞 黄鸿新

维生素D 是人体必需的一类脂溶性类固醇衍生物，经两次羟基化后与细胞内维生素D 受体（Vitamin D receptor，VDR）特异性结合后，发挥其生理作用。维生素D 缺乏会引起骨骼系统、肌肉系统、心血管系统、免疫系统、神经系统、糖代谢、细胞增殖分化、内分泌系统、肿瘤等相关疾病。血清25-羟基维生素D（25-hydroxyvitamin D，25-OH VD）浓度被认为是测定全面维生素D 状态的最可靠指标［1-3］，因而可用于测定患者是否出现维生素D 缺乏。《维生素D 及其类似物临床应用共识》指出：血清25-OH VD 水平检测已被公认为反映维生素D 状态的最合理指标［2］。全球范围内有很多人25-OH VD 缺乏，因此定期检测25-OH VD 水平确保其充足对疾病预防意义重大［4-6］。本文综述了液相色谱-串联质谱法、化学发光分析法、酶联免疫法、克隆酶供体免疫测定法、免疫层析法、胶乳免疫比浊法共6 种检测25-OH VD 的方法，并对各个方法的优点和不足进行分析，以期为临床选择25-OH VD 的检验方法提供指导。

1 我国25-OH VD 检测试剂盒注册情况

《体外诊断试剂注册管理办法》将25-OH VD检测试剂盒分为第二类［7］。截止2020年11月30日，检索国家药品监督管理局（以下简称国家局）国产医疗器械数据库发现，目前国内25-OH VD 检测试剂盒涉及的方法学主要包括液相色谱-串联质谱法、化学发光分析法、酶联免疫法、克隆酶供体免疫测定法、免疫层析法、胶乳免疫比浊法。

2 25-OH VD 检测试剂盒检测方法及其原理

2.1 液相色谱-串联质谱法（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）

LC-MS/MS 的原理是利用被检测物质25-OH VD2/D3 与背景干扰物如基质中的其他内源性物质在流动相和固定相中分配系数的不同进行分离。待测样本经过色谱柱分离后流出，进入质谱离子源离子化，形成不同质荷比的气相带电离子。在电场的作用下，带电离子进入Q1 四极杆质量分析器，目标母离子被特定电场选择出来，通过Q1 四极杆，进入Q2 碰撞池，在碰撞气体（氩气）和一定碰撞电压的作用下，目标母离子被打碎成若干子离子。这些子离子进入Q3 四极杆质量分析器后，在特定电场作用下，只有目标子离子被选择出来，能通过Q3 四极杆，进入检测器中进行检测。整个扫描过程中目标分析物离子经过两次选择后，特异性和灵敏度可大大提高，最后得到对称性良好的色谱峰。通过色谱峰的时间和峰面积等信息可以对物质进行定性或定量处理。采用内标法定量时，由于样品中掺入了同位素标记的25-OH VD2/D3，能够很好地消除基质效应，其分析准确度优于外标法。另外，LC-MS/MS 法能够有效区分25-OH VD2/D3，比免疫法灵敏度更高，是临床检测维生素D 的金标准［2，8-10］。

研究表明，LC-MS/MS 法测定干血点、血浆、血清样本中的25-OH VD2/D3，具有灵敏度高、分析快速、准确性好、仪器稳定等特点［11-12］。郑仁锦等［13］利用乙腈提取、饱和硫酸锌沉淀蛋白、然后用正己烷萃取的方法建立了超高效液相色谱-串联质谱法-同位素标记快速测定血清25-OH VD3 的方法，该方法用于美国国家标准与技术研究院NIST972a 质控样品及实际样品中25-OH VD的测定，获得了满意的结果。广州金域医学检验中心有限公司联合广州医科大学金域检验学院通过引入自动化取样平台、前处理平台、更换色谱柱、将单通道液相改为多通道液相系统等措施将LC-MS/MS 法检测25-OH VD 过程中样本取样环节检测效率提升了21%，样本前处理环节检测效率提升了74%，以及液相分离环节检测效率提升了63%［14］。

为了促进维生素D 标准化工作，2010年维生素D 标准化计划（The Vitamin D Standardization Program，VDSP）启动，VDSP 通过建立参考测量体系给美国国家标准和技术研究院（The National Institute of Standards and Technology，NIST）提供标准参考物质（Standard Reference Materials，SRM），从而促进全球包括商业化和自建方法在内的实验室25-OH VD 检测方法的标准化［15-16］。NIST 和比利时根特大学建立了同位素LC-MS/MS 法定量测定血清中25-OH VD2、25-OH VD3 的参考方法，得到了检验医学溯源性联合委员会（The Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）的认可［17-19］。但是LC-MS/MS 法仪器昂贵，安装条件严格，需要较大场地方可满足要求；样本前处理复杂，检测通量比较低，比较难适应临床大批量样本的需求；手工操作比较复杂，操作人员需要经过比较专业的培训，难以推广；尽管被公认为检测25-OH VD 的金标准，LC-MS/MS 法仍然易受3-epi-25OH-D3 和3-epi-25OH-D2 等异构体的交叉影响，尤其对婴幼儿的检测易出现假阳性［20-23］。另外，由于色谱和质谱条件等未标准化，不同实验室之间的处理方法和色谱条件等不同，对同一个体也会产生不同的临床评价。

截至2020年11月30日，国内已经取得注册证的LC-MS/MS 法测定25-OH VD2/D3 的试剂盒厂家有广州可力质谱医疗器械有限公司、广州丰华生物工程有限公司、上海复星长征医学科学有限公司等10 家公司。根据查询数据可知，以上厂家都是2019 和2020年获得的注册证，各家在色谱和质谱条件上也各有差异，因此要将LC-MS/MS法标准化，国内亟需解决25-OH VD 国家标准品的制备工作。

2.2 免疫法

已注册的产品设计原理主要为竞争法。

2.2.1 化学发光分析法（Chemiluminescence Immunoassay，ECLIA）

涉及的检测试剂盒按其发光机理具体可分为直接化学发光法、酶促化学发光法、电化学发光法［24］。

张旋等［25］对雅培全自动化学发光免疫分析仪测定25-OH VD 的检测性能进行验证和评估，与LC-MS/MS 法的检测结果比较表明，雅培全自动化学发光免疫分析仪可以满足临床检测的要求。邢晏等［26］利用电化学发光技术验证血清25-OH VD试剂盒的性能指标，结果表明ECLIA 检测25-OH VD 具有检测周期短、灵敏度和自动化程度高、成本低等优点。卜玲等［27］建立了一种25-OH VD 磁微粒化学发光免疫分析法，通过检测抗体-抗原衍生物-磁珠的复合物的光信号来测定样本中25-OH VD 的浓度，实验结果表明此方法具有省时、快速、稳定性和重复性好等优点，能够克服ELISA 法结果受反应时间、温度、加样等因素的影响。目前，化学发光分析法虽然灵敏度高，但是其检测成本较高，且需要特定的化学发光仪，导致其在25-OH VD 的临床检测中应用范围较小。

2.2.2 酶联免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）

ELISA 一般采用竞争法原理对样本中的25-OH VD 进行定量检测。该法在临床上虽然还保有一定的使用量，但因操作繁琐，已很少有公司再继续开发。

ELISA 和化学发光法检测结果间的相对标准偏差随着25-OH VD 浓度的升高而减小［28］。武姗姗［29］应用SPSS 软件比较LC-MS/MS、ECLIA 以及ELISA 两两方法测定血清25-OH VD 结果的相关性和一致性，结果显示25-OH VD2 含量极低时，三种方法测定血清25-OH VD 呈高度正相关，LC-MS/MS 和ELISA 之间的结果一致性良好。

截至2020年11月30日，目前国内已经拿到注册证的酶联免疫法检测25-OH VD 或25-OH VD3 的试剂盒有广州菲康生物技术有限公司、北京正旦国际科技有限责任公司等6 家公司。

2.2.3 克隆酶供体免疫测定法（Cloned Enzyme Donor Immunoassay，CDEIA）

CDEIA 又叫酶供体竞争法，基于β-半乳糖苷酶α-互补性原理，利用DNA 重组技术制备酶受体（Enzyme Accept，EA）和酶供体（Enzyme Donor，ED）两个片段的β-半乳糖苷酶。EA 和ED 只有在合适条件下结合在才具有酶活性，利用EA 和ED特性建立的均相酶免测定称为CDEIA。CDEIA 同样采用竞争法原理进行检测，ED 标记的25-OH VD 抗原与其特异性抗体结合后由于空间位阻不能再与EA 结合形成具有活性的β-半乳糖苷酶。反应平衡后，剩余的ED 标记25-OH VD 抗原与EA 结合形成具有活性的酶，加入底物测定酶活力，酶活力的大小与样本总25-OH VD 抗原标本含量成正比，通过特定波长的吸光度变化值，可以得出25-OH VD 的浓度。

上海复星长征医学科学有限公司的“25-羟基维生素D 测定试剂盒（克隆酶供体免疫测定法）”是国内首个在全自动生化仪上用于检测血清样本中25-OH VD 的试剂盒，比市场同类产品有一定优势，操作简便，其检测结果与英国Immunodiagnostic Systems Limited 公司生产的试剂检测结果的相关性良好，各项分析性能完全能够达到指标要求，可为临床诊断提供科学依据［30］。

2.2.4 荧光免疫层析法（Fluorescence Immunochromatography Asaay，FICA）

荧光免疫层析技术多采用竞争法原理设计，将预处理后含有待测组分的样本与荧光物标记的25-OH VD 单克隆抗体结合，形成荧光物-抗体-抗原的复合物。在层析作用下，该复合物沿着硝酸纤维膜向前层析至检测区（T 区），与T 区包被的25-OH VD-BSA 修饰抗原竞争结合。游离的荧光标记抗体层析至质控区（C 区），与C 区包被的二抗结合结合，形成质控区的荧光条带。在激发光源的作用下，荧光物质发射特定波长的荧光信号，荧光免疫分析仪俘获荧光信号。由于样本中的25-OH VD 与T 区的修饰抗原呈竞争关系呈竞争关系，因而T 区荧光强度与样本中的25-OH VD 浓度成反比，荧光免疫分析仪通过信号转化及设定的定标曲线自动转化为定量数值，计算出样本中25-OH VD 的浓度。

沈骏［31］利用量子点具有激发光谱宽，发射峰窄而对称，抗光漂白能力强等特点，建立了量子点荧光微球免疫层析法检测25-OH VD 的方法，结果表明方法精密度高、准确性良好。

普通荧光免疫层析法反应时间短，检测成本较低，对检测人员的要求不高，方便其在基层医院广泛推广，但是存在灵敏度低、重复性差等问题。基于此普菲特益斯生物科技（北京）有限公司研发了一种高灵敏检测25-OH VD 的时间分辨荧光免疫层析检测试剂，该方法试剂盒既有普通荧光免疫层析法的优点，又可以解决灵敏度低等问题。但缺点依然是只能检测总25-OH VD［32］。

2.2.5 胶乳免疫比浊法（Latex Immunoturbidimetry）

胶乳免疫比浊法主要利用抗体标记的胶乳微球与抗原反应形成交联网结构，它会引起特定波长的吸光度发生改变，吸光度的变化与血清样本中的25-OH VD 的含量成正比。

深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司的“25-羟基维生素D（25-OH VD）测定试剂盒（胶乳免疫比浊法）”利用胶乳免疫比浊法测定人血清中25-OH VD 的含量。该方法与普通临床生化检测的使用方法相似，但由于反应成分较多，目前市面上多使用三试剂的形式，如迈瑞、美康等。该方法可适用于全自动生化分析仪，实现自动化操作，血清样本无需进一步前处理步骤即可检测，出结果时间短，一般在10 分钟内可测出浓度。该方法参与反应的成分较多，且是生物活性物质，如底物、酶、抗体等，由于涉及抗体和酶的相互作用，抗体和酶等关键原材料筛选对于方法的建立至关重要，另一方面，各成分之间的比例协调对方法的线性、灵敏度有很大影响。因此该方法的原材料筛选及配方开发都有较大的难度。同时，由于相关的酶、抗体要求较高，原料本身的获取不易，而进入生产端的检验难度也相应提高，因此也加大了该方法的研发及制造成本。目前胶乳免疫比浊法相关的检测试剂盒厂家比较少，查询数据显示目前有13 家企业获得注册证。

3 结论

综上所述，相比于LC-MS/MS 法，免疫法检测样本用量少、检测设备相对便宜、仪器操作简单，适用于在中层和基层医院开展。但是与LC-MS/MS 法相比，免疫法易存在以下问题：①基质效应和交叉反应，容易使检测结果偏高；②检测结果为总25-OH VD，易低估25-OH VD2 的水平，导致总25-OH VD 检测结果偏低；③无法区分25-OH VD2 和25-OH VD3，导致免疫法特异性差。即便是LC-MS/MS 也面临5-OH VD 与结合蛋白彻底分离，的问题。众方法中特别是ELISA 检测时间较长，人工操作繁琐，因此不适合单样本检测。总之，目前无论哪种免疫法的试剂盒在检测精确性上都无法与LC-MS/MS 25-OH VD 检测试剂盒媲美。

尽管25-OH VD2 和25-OH VD3 的结构差异小，但是由于二者的活性和治疗效果有一定的差异，因此分别检测25-OH VD2 和25-OH VD3 并对二者活性和功能单独进行评价，是正确评估维生素D 水平和维生素D 补充疗法疗效的必然选择。所以LC-MS/MS 的普及和方法标准化将是未来发展趋势之一。

实际中开展检验项目时，应综合考虑费用、空间、耗时等问题，每个单位都可以根据自身需求选择不同的检测方法，然而实现所有方法一致性和可比性的最佳途径仍然是制定标准化和规范性的参考测量程序与国家标准品。