耳聋基因突变检测试剂盒行业标准的建立

张娟丽 曲守方 孙楠 张文新 孙晶 于婷★ 黄杰★

耳聋是一种普遍高发的听力障碍性疾病，病因复杂。环境因素、遗传因素均可导致耳聋的发生，其中至少有50%的学语前耳聋是由遗传因素导致的。大多数遗传性耳聋是由几个较为常见的热点突变引起的［1-2］，其中中国人群常见耳聋突变主要包括GJB2、GJB3、SLC26A4以及线粒体的12S rRNA基因突变［3-5］。目前有多种耳聋基因突变检测试剂盒，方法包括芯片法、荧光PCR 法、飞行时间质谱法、测序法等。由于各试剂盒的检测原理、检测的突变位点及数量存在一定差异，需要对这类试剂盒的性能指标进行统一尺度的评价，来保障临床样本检测结果的准确性。建立耳聋基因突变检测试剂盒的行业标准就势在必行。中国食品药品检定研究院（以下简称本院）已完成荧光PCR 法、微阵列芯片法、测序法等多个耳聋基因检测试剂盒的注册检验，具有丰富的检验经验，并且在2017年研制完成耳聋基因突变检测国家参考品［6］，为该类试剂盒的注册检验提供了可靠的参考品，该参考品已经在全国范围内使用了近2年。本院联合1 家省级医疗器械检测机构及7 家企业开展了建立耳聋基因突变检测试剂盒行业标准的工作，现将该行业标准的验证情况作一简要汇报。

1 材料与方法

1.1 试剂盒

十五项遗传性耳聋相关基因检测试剂盒（微阵列芯片法），北京博奥生物有限公司生产；九项耳聋基因检测试剂盒（生物芯片法），北京博晖创新生物技术股份有限公司生产；耳聋易感基因检测试剂盒（PCR+导流杂交法），潮州凯普生物化学有限公司生产；先天性耳聋基因检测试剂盒（荧光PCR 法）、药物性耳聋基因检测试剂盒（荧光PCR法）和PDS 基因检测试剂盒（荧光PCR 法），济南英盛生物技术有限公司生产；四项耳聋基因检测试剂盒（ARMS-PCR 法），中生北控生物科技股份有限公司生产；二十项遗传性耳聋基因突变检测试剂盒（飞行时间质谱法），广州市达瑞生物技术股份有限公司生产；耳聋基因突变检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法），华大生物科技（武汉）有限公司；遗传性耳聋基因检测试剂盒（测序法），广州市金圻睿生物科技有限责任公司。

1.2 参考品

耳聋基因突变检测国家参考品：批号：360013-201701，包含20 个阳性参考品（P1-P20）和3 个阴性参考品（N01～N03）。除P19 和P20 为DNA 样本外，其余参考品均为干血片。重复性参考品由各试剂厂家自行提供。

1.3 主要检测仪器

10K-B 微阵列芯片扫描仪（北京博奥生物有限公司）、核酸芯片检测仪（北京博晖创新生物技术股份有限公司）、HB 2012A 导流杂交仪（潮州凯普生物化学有限公司）、ABI 7300 荧光PCR 仪（美国ABI 公司）、Bio-Rad S1000PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）、DR MassARRAY 飞行时间质谱检测系统（广州市达瑞生物技术股份有限公司）、BGISEQ-500基因测序仪（华大生物科技（武汉）有限公司）、BioelectronSeq 4000 基因测序仪（东莞博奥木华基因科技有限公司）。

1.4 行业标准中各技术指标及验证方法

在充分调研并分析各试剂质量标准的前提下，结合临床应用情况，按照GB/T1.1 2009 的要求，制定了耳聋基因突变检测试剂盒行业标准，内容包括前言、范围、规范性引用文件、要求、试验方法、标签和使用说明书以及包装、运输、贮存7 个条款。其中“要求”和“试验方法”是核心内容，要求中包含外观、检测限、准确性、特异性和重复性。

1.4.1 外观

在自然光下目视检查。制造商应根据自己产品的包装特点规定适当的外观要求。一般应有试剂盒各组分组成、性状；内外包装、标签清晰等的要求。

1.4.2 检测限

应包括试剂盒检测范围内的全部基因型别。按照说明书中的操作方法，取国家阳性参考品中未包含的试剂盒检测范围内突变位点的企业检测限参考品，以及取试剂盒检测范围内的国家阳性参考品稀释至试剂盒声称浓度后，各检测1 次；或取企业检测限参考品，各检测1 次，均要求检出相应的基因型别。

1.4.3 准确性

应包括试剂盒检测范围内的全部基因型别。按照说明书中的操作方法，取国家阳性参考品中未包含的试剂盒检测范围内突变位点的企业阳性参考品，以及取试剂盒检测范围内的国家阳性参考品，各检测1 次；或取企业阳性参考品，各检测1次，均要求检出相应的基因型别。

1.4.4 特异性

按照说明书中的操作方法，取国家阴性参考品和试剂盒检测范围外的国家阳性参考品，各检测1 次；或取企业阴性参考品，各检测1 次，结果均应为阴性或野生型。

1.4.5 重复性

根据试剂盒检测范围内的基因种类及突变类型来确定重复性参考品，每种基因至少选择1 个突变位点/类型。按照说明书中的操作方法，取企业重复性参考品，重复检测10 次，结果应一致且应检出相应的基因型别。

2 结果

2.1 外观

全部试剂盒外观均满足要求。

2.2 检测限

将试剂盒检测范围内国家阳性参考品稀释至1 ng/μL，大部分厂家的试剂均可检出，仅厂家E 在检测1 ng/μL 浓度的国家参考品时，在1494 反应体系检出P4、P6、P16、P19、N03 异常，P12 突变，而未能检出P20 突变；在SLC 反应体系检出P4、P15、N01 异常，P12 突变，而未能检出P11 的IVS7-2 突变；在GJB 反应体系检出P4、P15、N01 异常，多个国家参考品检出235delC 突变；以上考虑为样本浓度低于试剂盒声称检测限所导致的结果异常，后按照试剂盒的检出限稀释样本至5 ng/μL 时，均可检出。

根据以上检测结果以及网上征求意见和多次会议讨论，最终确定检测限指标如下：对于芯片法，检测限应不高于20 ng/反应或2 ng/μL；对于质谱法，检测限应不高于5 ng/反应或1 ng/μL；对于荧光PCR 法，检测限应不高于10 ng/反应或2 ng/μL，若PCR 扩增后采用化学显色或者电泳-凝胶成像等方法对结果进行判读的试剂盒，检测限应不高于15 ng/反应或1 ng/μL；本行标中未涉及到其他原理试剂盒的检测限可参考以上进行设定；并且检测结果可仅满足总反应量或者浓度两个指标之一；对于mtDNA12S rRNA突变百分比的检测限暂不做要求，企业可根据临床样本实际突变百分比，进行系列稀释，自行确认试剂盒的突变百分比检测限。

2.3 准确性

大部分厂家结果满足要求。除已知突变外，厂家C 还检出国家参考品P19 的299M 杂合突变，国家参考品P9、P16 的1555 突变，不满足要求。

2.4 特异性

大部分厂家结果满足要求。厂家C 检出国家阳性参考品P14（突变位点为试剂盒检测范围外，作为阴性参考品使用）存在1555 突变，不满足要求。

2.5 重复性

检测企业重复性参考品，结果均满足要求。由于存在多种检测方法的试剂盒，虽均为定性产品，但是部分试剂盒可以产出用于计算变异系数的数据，因此，最终确定的要求也有所不同，要求：①对于质谱法、芯片法等检测原理的试剂盒，以及PCR 扩增后采用化学显色或者电泳-凝胶成像等方法对结果进行判读的试剂盒，重复性参考品的检测结果应一致且型别准确；②对于荧光PCR 法检测试剂盒，重复性参考品的检测结果应型别准确，且相应检测通道Ct 值（或Tm 值或关键性判读指标）的变异系数（CV%）应不大于5.0%。

3 讨论

运用分子诊断技术检测耳聋基因突变位点的检测方法较多，除传统的限制性片段长度多态性法以外，还有：①一代测序技术，Sanger 测序目前仍为基因检测的金标准，但成本高、耗时长、对操作人员要求高；②基因芯片技术，具有自动化、高通量、微型化，结果判读方便，但对样本DNA 质量要求高，且可检测的突变位点有限；③基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，具有准确高效、检测位点多等特点，但该技术对样品纯度要求更高、仪器昂贵、对人员技术要求高；④下一代测序（NGS）技术，通过大量数据和生物信息学分析手段来判定，具有通量更高、速度更快等优点。此外，还有高分辨率熔解曲线技术、侵染检测技术、多色探针熔解曲线分析技术等，上述方法各有优劣［7-11］。目前已有多家企业根据自己的技术优势及实际情况，研发了多种耳聋基因突变检测试剂，主要为测序法、芯片法、质谱法、PCR 法。国内已上市销售的耳聋基因突变检测试剂盒有9 个，尚有多家企业正在进行相关工作。这些试剂在临床上已得到了广泛的应用，超过60 万新生儿受益。然而各类试剂盒因检测原理、检测位点和检测能力范围不同，存在一定技术水平差异，2019年之前并无这类试剂盒的行业标准或国家标准，客观上无法进行统一尺度的评价，所以本院开展了耳聋基因突变检测试剂盒行业标准的申报。

本次行标起草单位及验证单位覆盖了国内耳聋基因突变检测试剂盒的主流厂家，方法也全面覆盖，其优势在于意见来源广泛且验证数据充分，使确定的各指标更加严谨、更具可操作性。在检测限项目中，由于各方法原理本身的限制，个别试剂在样本浓度为1 ng/μL 的条件下，难以正确检出突变位点，此时可考虑适当提高检测限浓度，但并不直接提高至该检测试剂盒声称的检测限。这样做的目的是，既不违背现有试剂盒的客观检测水平，同时可促进企业改进方法，提高检出率。在准确度和特异性项目中，个别试剂出现了假阴性和假阳性的结果。出现以上情况，企业应积极查找原因，解决问题。这也是建立行业标准的意义所在。要指出来的是，在制定过程中，有以下几个讨论热点问题：①适用范围：由于测序法与PCR 或者芯片法等方法的检测原理存在一定差异，有其特征性的性能指标，如建库失败率，测序深度、测序质量评价等，不完全适用本行业标准的应用范围，故经讨论，去掉适用范围中的基于测序原理的耳聋基因突变检测试剂盒；②检测限项目中：a.对于线粒体异质性的确认受限于目前的检测技术，以及临床阳性样本的难以获得性，不列为评价指标。b.对于其他位点的突变，因各检测方法原理不同，分别确定检测限指标，并通过实验来确认；c.干血片提取后的DNA 含量一般较低，质量较差，各试剂检测原理及上样量不同，如果按提取总量制定检测限指标，并不能客观地评估试剂盒的检测能力，最终选择总反应量或浓度来评价试剂盒的检测限；不再对重复性参考品的性质描述为强/中阳性和弱阳性，改为根据突变基因种类设置重复性参考品。

综上所述，该行业标准正式发布以后，与耳聋基因突变检测国家参考品配合使用，将有助于促进各厂家改进检测能力，提高试剂质量，有效提高耳聋患儿的检出率，实现优生优育。同时，将为该类产品的研制、检测检验及上市后的监管工作提供必要的技术指导和依据。