结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂相关问题探讨

刘容枝 方丽 徐超

作者单位：国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心，北京100081

世界卫生组织（world health organization，WHO）2017年全球结核病报告显示，中国结核病患者的例数位居世界第三，并且是世界三大耐多药结核病高发国家之一。耐药结核病指由耐药结核分枝杆菌引起的结核病。传统药敏试验是确诊耐药结核病的唯一方法，但其周期长，容易延误治疗。基于分子生物学方法的结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂（以下简称基因药敏试验）可快速检测结核分枝杆菌基因组中与特定耐药相关的基因突变，较快确定患者对某种特定结核药物的耐药性［1-3］。

笔者长期从事结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂的技术审评工作。在本文中，笔者将总结分析该类试剂的临床应用价值和注册情况，同时对该类试剂设计研发时应重点关注的产品设计、主要原材料选择和性能评估等技术问题进行探讨，以期对生产企业进行相关试剂的注册申报进行技术指导。

1 该类试剂的临床使用场景

在临床实践中，临床机构使用该类试剂对来自确诊结核病患者的临床样本培养物进行检测。如从临床样本培养物中检出结核分枝杆菌基因组中与某种结核药物耐药相关的基因突变，则提示提供该临床样本的结核病患者可能对该结核药物耐药，该结核病患者为对某种结核药物耐药的耐药结核病患者。

与传统药敏试验相比，基因药敏试验敏感性更高，操作更简单可行，且能更快获得结果。因此，基因药敏试验一经问世，即获得许多临床使用单位的青睐。目前临床可用的基因药敏试验试剂多为一线结核药物耐药检测试剂。随着我国耐药结核病患者的急剧增多，二线结核药物耐药结核病病例也频见报道，临床急需二线结核药物基因药敏试验检测试剂［4-5］。

2 该类试剂的注册情况

该类试剂采用分子生物学方法定性检测临床样本培养物中结核分枝杆菌基因组中与特定耐药相关的基因突变，用于耐药结核病的辅助诊断，便于临床医生合理选择结核药物。截至目前，经国家药品监督管理局批准的国产基因药敏试验试剂有9 个，进口基因药敏试验试剂有3 个，用于耐药性检测的药物类型主要为结核患者一线药物，包括利福平、异烟肼、链霉素和佛喹诺酮等。方法学主要包括线性杂交酶显色法、熔解曲线法、基因芯片法和一代测序法等。

3 该类试剂设计研发时应重点关注的技术问题

3.1 质控

为避免临床使用时假阴性和假阳性结果对患者的危害，应对该类试剂的检测过程进行有效质控。因此，该类试剂应设立内标、阴性对照和阳性对照，以对样本核酸分离纯化、配液及加样、试剂及仪器性能、扩增反应抑制物（管内抑制）、交叉污染和靶核酸降解等进行合理质控，避免出现假阴性或假阳性结果。内标、阴性对照和阳性对照均应参与样本核酸的平行提取纯化。

3.2 主要原材料研究

对于该类试剂而言，主要原材料主要为引物、探针、反应液和聚合酶。该类试剂一般可同时检测多个基因突变位点。因此，产品设计时需设计多对引物和探针。如多对引物和探针存在于一个反应体系，则应在设计开发时着重验证不同引物探针对彼此的干扰。鉴于一般引物探针为外购，应提交对引物探针供应商的选择依据及研究数据。对于自制聚合酶，其生产工艺必须相对稳定，生产企业应建立稳定的自制聚合酶的工艺流程及质量标准。

3.3 企业参考品

企业参考品对该类试剂的质量控制至关重要。企业应建立科学合理的阳性参考品、阴性参考品、精密性参考品和最低检出限参考品。阳性参考品、最低检测限参考品和精密度参考品，应包括试剂声称的全部基因突变类型，且各参考品的突变类型需经过金标准方法或已上市同类分型试剂的确认。常见突变类型的上述参考品至少有1～2 种突变类型采用菌株，其他突变类型的上述参考品可以采用含有突变的核酸。阴性参考品可采用经确认靶序列未发生突变的结核分枝杆菌菌株或试剂声称的其他无关突变类型的核酸等。

4 分析性能评估

分析性能评估资料是注册申报资料的重要技术文件。该类试剂的分析性能评估资料需要着重考虑最低检测限、分析特异性和配套核酸提取试剂的提取效率等。

扩增反应终体系中的突变序列百分率和总核酸浓度两个因素对最低检测限的影响较大，终体系中突变序列的百分率越高、所含的核酸量越多，则越容易检出。而终体系中的这两个因素是由临床样本中的结核分枝杆菌耐药菌与野生菌的含量和相对比例决定的。因此，在进行最低检出限研究时，应考虑100%耐药比例下，耐药菌株/突变核酸的最低检测浓度；同时，应考虑不同菌株/核酸浓度、各种耐药比例的最低检测限。

还应特别考虑申报产品的分析特异性，关注野生型序列是否会检出突变阳性，以及申报产品声称的全部突变类型间是否存在交叉。另外，还需对核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状、采样部位正常寄生或易并发的其他病原体进行交叉反应的验证。

另外，还需特别注意干扰物质对申报产品检测性能的影响。应考虑内源性干扰和外源性干扰。内源性干扰主要考虑临床样本中可能含有的物质对申报产品检测性能的影响，一般采用不含待检野生/突变靶标的相应临床样本进行试验。而外源性干扰则主要考虑外源性药物带来的干扰，包括异烟肼、利福平、抗生素和鼻腔喷雾剂或滴鼻剂等常见药物的干扰等。

鉴于核酸提取效率对申报产品的后续检测具有重要影响，生产企业还需考虑不同样本前处理方法和核酸提取纯化方法对申报产品检测性能的影响。如某种样本类型可采用几种方法进行样本前处理或采用几种方法进行核酸提取纯化，生产企业应提交适用的样本前处理方法或核酸提取纯化方法与后续试验配合进行的性能试验，以证明不同的样本前处理方法或核酸提取纯化方法不影响检测结果。

5 结论与展望

本文总结了结核分枝杆菌耐药基因突变检测试剂的临床应用价值和注册情况，并对该类试剂设计研发时应重点关注的产品设计、主要原材料选择和性能评估等技术问题进行探讨，以期对生产企业进行相关试剂的注册申报进行技术指导。生产企业应关注方法学本身的特点，不断优化原材料与体系设置，不断提高产品性能，确保产品满足临床使用需求。