病毒性肝炎血清标志物检测方法新进展

李轶春

病毒性肝炎是指由病毒引起的肝脏炎症，根据病原学分类将其分为甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）、戊型肝炎病毒（hepatitis E Virus，HEV）。病毒性肝炎大流行对生命、社区和卫生系统将会造成重大损失。据估计，全球每年有140 万人死于急性感染以及与肝炎相关的肝癌和肝硬化，其中，大约47%是由HBV引起的，48%是由HCV 引起的，其余是由HAV 和HEV 引起的［1］。HBV 感染是导致中国人群发生肝癌的主要危险因素，目前，仍有930 万慢性HBV 感染者［2］，与HBV 相关的肝癌患者约占所有肝癌患者的80%［3-4］。预计到2030年全球将慢性肝炎感染率从目前的600～1 000 万例降低到90 万例，将慢性肝炎年死亡率从140 万例降低到50 万例以下［5］。此外，病毒性肝炎也是导致艾滋病毒感染者死亡的一个日益严重的原因，同时感染艾滋病毒及HCV 人数约达290 万，260 万人感染了HBV［6］。病毒性肝炎是一项国际公共卫生挑战，因此，提高病毒性肝炎的诊断率，找到灵敏度高、特异性强的检测指标，对降低病毒性肝炎的发病率、癌变率、致残致死率至关重要。在这篇综述中，笔者将总结目前关于病毒性肝炎的血清标志物及检测方法，旨在为临床筛查提供思路，以期早发现、早预防，早诊断、早治疗。

1 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA 是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。ELISA 过程包括抗原吸附在固相载体上（即包被），加待测抗体，加相应酶标记抗体，生成抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物，与该酶的底物反应生成有色产物。检测者采用分光光度计的光吸收计算抗体的量，并将待测抗体的定量与有色产生成正比。

2 时间分辨荧光免疫技术（Time-Resoled Fluoroimmunoassay，TRFIA）

TRFIA 是运用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物代替荧光物质、同位素或酶标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，当反应体系发生后用TRF 仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值来判断反应体系被分析物的浓度达到定量分析之目的。通过利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光，而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0，从而提高了检测的灵敏度，缩短了急性乙肝检测的“窗口期”。TRFIA 具有零本底、灵敏度高、线性范围宽、试剂有效期长、标准曲线稳定性好、易于自动化等特点。

3 电化学发光免疫分析法（Electro-Chemiluminescence Immunoassay，ECLIA）

ECLIA 主要在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，是采用电化学发光剂三联吡啶钌标记Ab 通过Ag-Ab 反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab 进行定量/定性，是继TRFIA 之后的新一代标记免疫测定技术，是电化学发光和免疫测定相结合的产物，具有敏感度高、特异性强、重复性好、测定范围宽、试剂稳定、无毒害无污染、有效期长、操作简单、耗时短、易于自动化等特点。

4 化学发光微粒子免疫分析法（Chemiluminescent microparticle immunoassay，CMIA）

CMIA 分为小分子抗原物质的测定采用竞争法和大分子的抗原物质测定采用双抗体夹心法，主要包括两种反应过程：（1）竞争反应：用过量包被磁颗粒的抗体，与待测的抗原和定量的标记吖啶酯抗原同时加入反应杯温育，其免疫反应的结合形式有两种，一是标记抗原与抗体结合成复合物；二是测定抗原与抗体的结合形式；（2）双抗体夹心法：标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合成一种反应形式，即包被抗体-测定抗原-发光抗体的复合物。

5 荧光定量聚合酶链反应（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQPCR）

FQPCR 包括探针类和染料类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指导扩增产物的增加，其具有特异性好、灵敏度高、线性关系好、线性范围宽、操作简单、安全、自动化程度高、防污染、速度快、高通量等特点。染料类主要原理为当荧光共振能量转移，外来的光源激发供体荧光染料发出荧光，当其发射波长与受体荧光染料的吸收波长部分重叠，且两者的距离很近时，受体荧光染料吸收供体荧光传递的能量而激发出另一波长的荧光，同时将供体荧光淬灭。

6 免疫学方法检测技术在临床中的应用

黄旭华等人［7］分别以ELISA、胶体金法行免疫学检验HAV，分析检验结果，研究结果显示，采用ELISA 检测HAV 的诊断准确率较高。邹锦群等人［8］在2017年丰城市300 人5 种传染病抗体水平监测分析研究中采用ELISA 检测HAV 抗体，结果显示HAV Ab 被检出的阳性率较高，侧面印证了ELISA 用于检测HAV 的临床可行性。黄妩姣等人［9］分别用ECLIA 和ELISA 检测HAV 抗体IGM，以临床诊断为标准，比较并分析了阳性符合率，研究结果显示，ECLIA 检测HAV-IgM 的敏感度为62.5%、特异性为100.0%、阳性检出率为4.3%，ELISA 检测的敏感度为100.0%、特异性为71.3%、阳性检出率为33.6%，通过结果可以看出，ECLIA 和ELISA 两种检测方法对于检测HAV 的一致性很低，但二者各有优势，ELISA 检测HAV 的敏感度高，ECLIA 检测HAV 的特异性强。此外，王峰蕾等人［10］参照美国临床和实验室标准化协会的EP15-A2 文件和中国合格评定国家认可委员会的CNALCL39 相关文献，对全自动酶联免疫分析仪测定HAV-IgM 的精密度、检出限、正确度以及试剂盒的临界值进行验证，结果显示，阳性结果符合率为100%，提示全自动酶联免疫分析仪检测方法更标准、规范，结果更客观。以上学者的研究均证实了ELISA 检测法在HAV 筛查中的广泛应用及特异性、敏感性。

焦阳等人［11］探讨分别采用ECLIA 和ELISA 两种不同免疫检验方法检测HBV 感染血清学标志物的临床对比情况，结果发现，ECLIA 检测HBV较ELISA 检测的准确率高，但在阳性检出率的对比上差别不大。赵超芬［12］对比用ECLIA、ELISA及TRFIA 检测HBV 标志物在诊断HBV 中的应用价值，结果发现，使用CLIA 法检测HBsAg、HBsAb、HBeAg 的阳性检出率均为最高，使用ELISA法检测HBeAb 的阳性检出率最高，使用TRFIA 法检测HBcAb 的阳性检出率最高，使用TRFIA 法诊断HBV 的灵敏度和特异度均高于用ELISA 法，可以推测三种检测方法各有优势，临床中可根据患者的个体差异，选择不同的检测方法。王红翠等人［13］探讨了化学发光法及ELISA 法两种不同检测技术应用于乙型肝炎病毒核心抗体阳性率筛查中的临床价值及检测意义，结果发现化学发光法检测的阳性率更高，结果更准确，数据更客观真实，具有预测作用。上述结果表明ECLIA 和ELISA、CLIA 等检测方法在临床筛查HBV 各有优势，应根据临床实际选择单独检测或联合检测。

薛海玲等人［14］比较CMIA 法、ELISA 法在HCV 检测中的应用效果，结果发现，CMIA 法检测HCV-Ab 阳性率为100%，ELISA 法检测HCV-Ab阳性率为76.32%，CMIA 法检测HCV-Ab 的灵敏度高于ELISA 法，CMIA 法与ELISA 法检测HCV-Ab阳性一致率为72.32%，总一致率为92.21%，得出结论为CMIA 法测定HCV-Ab 的精密度、灵敏度、特异度、阳性预测值均较高。吴小文［15］搜集120 例HCV 患者血清标本，分别采用ELISA、ECLIA、荧光定量PCR 法进行检测，观察并分析三种检验方法的检验结果，检测结果显示，采用ELISA 检测HCV 的阳性率为73.33%，采用ECLIA 检测HCV的阳性率为75.00%，采用荧光定量PCR 法检测HCV 的阳性率为90.83%，检测准确率均较高，但仅有采用荧光定量PCR 法检测HCV 具有统计学意义。上述研究结果可以推测采用荧光定量PCR法检测HCV 结果最佳。

近年来，病毒性肝炎血清标志物检测方法不断发展、更新。神经生长因子（Neural growth factor，NGF）含有两种非共价结合单体，每个单体都有四个带有极性氨基酸序列的环区和两条β链。在肝脏微环境中，NGF 在受损肝细胞中表达，参与对肝损伤的控制过程，主要是通过p75NTR 对纤维化细胞发挥凋亡作用，并上调胆汁淤积性肝组织中的肝保护成分。Pereira［16］的研究发现具有与正调节、结构保守和因子生理学相关的多态性变异的患者表现出与病毒载量和肝酶相反的行为，表明NGF 和p75NTR 在炎症和纤维化的不同阶段相互作用。Sun［17］的研究发现循环蛋白有助于诊断与鉴别HBV 及肝衰竭，评估肝功能异常和预测肝病结果，发现HNF-1α 和HNF-4α 两种肝核因子与肝功能相关，富含组氨酸的糖蛋白（histidine-rich glycoprotein，HRG）可反映机体免疫功能的强弱，为临床制定诊断方案及治疗策略提供数据。基于超声的弹性成像和血清指标已被单独验证为慢性病毒性肝炎肝纤维化分期的无创方法，Udompap［18］以HBV 或HCV 单感染患者为研究对象，旨在比较病毒性肝炎患者瞬时弹性成像（transient elastography，TE）、剪切波弹性成像（shear wave elastography，SWE）、天冬氨酸转氨酶血小板指数和纤维化-4 指数（Fibrosis-4，FIB4）与肝纤维化分期的准确性，结果发现，使用M 或XL 探针的超声心动图是一种极好的弹性成像技术，可无创地预测HBV 或HCV 患者的肝纤维化程度，特别是晚期纤维化和肝硬化患者。SWE 点可以作为排除晚期纤维化和肝硬化的辅助超声工具。虽然FIB4的诊断准确性低于某些弹性成像技术，但在医疗技术有限的情况下，FIB4 在临床上可用于排除肝硬化。Khodjaeva［19］对6589 例病毒性肝硬化患者进行HBV 单次感染、HCV 感染和高密度脂蛋白重叠感染乙型肝炎表面抗原阳性肝硬化的流行病学调查，发现超过80%的HBV 表面抗原阳性肝硬化患者存在高密度脂蛋白双重感染，高密度脂蛋白似乎是晚期病毒性肝病和青少年肝硬化的主要原因。循环自耗蛋白（Autotaxin，ATX）在肝病患者中升高，特别是在HCV 病毒和丙型肝炎病毒/艾滋病感染的环境中，血浆ATX 水平部分归因于纤维化肝病继发的肝脏清除受损。Kostadinova［20］发现血浆ATX 与HCV 和丙型肝炎病毒/艾滋病感染期间的系统免疫激活参数有关，在开始无干扰素直接作用抗病毒丙型肝炎病毒治疗的几个月内，ATX 水平部分正常化，这与非纤维化肝病导致ATX 水平升高或丙型肝炎病毒介导的肝细胞活化一致。ATX、溶血磷脂酸和全身免疫激活参数之间的关系与丙型肝炎病毒感染、肝细胞癌等相关，认为ATX 水平通常与ATX 酶活性产物溶血磷脂酸的水平相关，是一种通过溶血磷脂酸受体传递信号的脂质介质；ATX-LPA 轴与丙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒/艾滋病感染环境中的系统性免疫激活相关；在慢性肝病毒感染期间，非纤维化和可逆成分导致ATX 水平升高。Joanna［21］对138 例慢性丙型病毒性肝炎患者进行了戊聚糖3（Pentosan 3，PTX3）与炎症活性和纤维化的生化和组织学参数的相关性研究，目的是探究PTX3 检测HCV 患者的临床显著纤维化的准确性，证实了PTX3 作为显著纤维化的单一标志。

7 小结与展望

不同的免疫学检测技术适用于不同的病毒性肝炎分型，为了实现2030年彻底将病毒性肝炎这一疾病彻底根除的终极目标，临床医师、科研专家还需更加努力，不断提高检测技术水平，不断更新检测设备及试剂盒，规范检测流程。