CRISPR/Cas9技术在心血管疾病动物模型的应用

陈慧玲 张然

(中国农业大学生物学院，北京 100193)

心血管疾病(CVD)在非传染性疾病中死亡率居于首位，高于肿瘤及其它疾病，且目前CVD患病率仍处于持续上升阶段。因此，CVD对人类健康构成极大地威胁。为了能更好地治疗CVD，动物CVD模型便成为人类探索该领域的重要介质。由于缺乏有力的基因组编辑工具，CVD模型的构建较为困难，因而人们对CVD的研究进展缓慢。在20世纪90年代末，ZFNs编辑技术的开发开启了第1扇定制核酸酶靶向基因组工程的大门。随后第2代基因编辑工具TALENs被开发利用，然而，由于ZFNs和TALENs技术操作相对复杂，会影响其使用。2013年第3代基因编辑工具CRISPR/Cas9技术问世，彻底引发生物医学研究领域新的革命。

1 CRISPR/Cas9技术

CRISPR/ Cas9系统包含1个gRNA，能够将核酸酶Cas9定位于基因组中的特定位置。gRNA由Cas9结合所必需的短RNA序列和一段约20个核苷酸序列组成。Cas9核酸酶包含HNH核酸酶和类RuvC核酸酶结构域。其首先识别PAM序列，该序列为目标DNA的侧翼序列。与PAM结合后，Cas9通过其HNH和RuvC催化结构域产生DNA双链断裂(DSB)，然后通过非同源末端连接(NHEJ)或同源重组修复(HDR)系统进行基因组修复。CRISPR/Cas9系统已经成为许多物种(如人类和小鼠细胞，斑马鱼等)中基因敲除和位点特异性敲除的新工具。

2 CRISPR/Cas9技术在CVD动物模型的应用

2.1 CRISPR/Cas9技术应用于动物CVD模型的构建

2.1.1 斑马鱼CVD模型的构建

斑马鱼胚胎几乎是透明的，允许观察内部结构而不需要侵入性的仪器。特别是心脏和血管很容易通过显微镜观察到，这使得心脏收缩、血流、血管大小和模式的连续可视化和量化成为可能[1]，而且斑马鱼与人类之间遗传关系较强，且分子信号通路显著相关，使得斑马鱼成为模拟复杂发育过程的有用工具。因此，许多科研工作者选用斑马鱼研究不同基因突变致CVD的机理。血浆低密度脂蛋白胆固醇升高是动脉粥样硬化和心血管疾病发生的主要危险因素，而LDL受体(LDLR)缺陷是人类家族性高胆固醇血症的主要原因。近年来，通过使用CRISPR/Cas9方法获得ldlr突变斑马鱼模型，在正常饲喂条件下，斑马鱼发展为中度高胆固醇血症；在采用高胆固醇饲喂5d后加重斑马鱼的高胆固醇血症和血管脂质沉积[2]。利用CRISPR/Cas9系统构建GTPBP3敲除斑马鱼，结果显示，GTPBP3基因缺失导致线粒体功能障碍，致使产生肥厚性心肌病表型，重现携带GTPBP3突变的HCM患者的临床表型[3]。

2.1.2 小鼠CVD模型的构建

CRISPR/Cas9系统已然成为制作遗传工程小鼠当下最流行的编辑工具，能够直接应用于胚胎。来自宾夕法尼亚大学的研究人员发现，血友病B家族在F9基因中携带一个新的突变Y371D，利用CRISPR/Cas9系统产生了不同的转基因小鼠模型，并证实了新的Y371D突变导致的血友病B表型比Y371S突变更为严重。该研究首次开发出一种双基因疗法，其能够将CRISPR/Cas9介导的基因靶向系统的关键组分运输到小鼠机体中来治疗B型血友病[4]。此外，Caroll等人已经培育出只在心肌组织特异表达的Cas9转基因小鼠，并通过将靶向Myh6的sgRNA 装载在AAV载体上注射入小鼠，实现Myh6的敲除，导致小鼠心脏功能受损和明显肥大[5]。因而CRISPR/Cas9系统可以探索心脏特异表达基因在心脏功能和发育中的特定作用，并有效纠正出生后/成年小鼠的遗传缺陷。

2.1.3 猪CVD模型的构建

猪和人的心血管系统在冠状动脉血管的大小、分布、血压、心率、心脏指数和最大氧气消耗等方面表现出相似之处，且具有相似的药物药代动力学。因而猪是研究人类CVD的重要模型。Huang等人利用CRISPR/Cas9系统同时靶向巴马小型猪载脂蛋白E (ApoE)和低密度脂蛋白受体(LDLR)基因，成功获得双等位基因敲除猪。该基因修饰猪的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、载脂蛋白B(APOE)水平明显升高[6]。Fang等人构建的ApoE -/-猪在常规饲喂条件下血浆胆固醇水平适度升高，但在高脂高胆固醇(HFHC)饮食6个月后，出现严重高胆固醇血症，并在主动脉和冠状动脉中出现类似人的动脉粥样硬化病变[7]。这些模型对CVD的研究和相关转化研究具有一定参考价值。

2.1.4 非人灵长类CVD模型的应用

NHPs基因组的精确修饰对生物医学研究的发展具有巨大推动力。然而NHPs具有性成熟时间长、繁殖率低、繁殖困难等特点，传统育种产生双等位基因突变NHPs，以进行功能缺失的研究非常具有挑战性。近年来，利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑使这一过程变得较为容易。目前利用CRISPR/Cas9技术，通过合子注射，已成功构建p53突变体猴，该模型对压力超载期间p53诱导的炎症如何导致心功能障碍，以及p53诱导的心血管细胞衰老为何促进动脉粥样硬化发生的研究具有重要意义[8,9]。

2.2 CRISPR/Cas9技术在CVD治疗中的应用

虽然针对CVD的药理学和侵入性治疗可以达到减轻症状和延缓疾病进展的目的，但目前仍然需要其它治疗方法来有效治疗甚至治愈CVD。AAV-CRISPR/Cas9成为研究者的首选。AAV是单链(ss)DNA载体，具有良好的安全性，能够在包括心脏在内的多种靶组织中实现持久地转基因表达。目前AAV-CRISPR/Cas9已用于缓解儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速(CPVT)、DMD等小鼠模型和DMD猪模型的病症。CPVT常由RYR2的功能获得性突变所引起，为实现长期有效地治疗CPVT，研究者给P10 Ryr2R176Q/+小鼠皮下注射AAV9-CRISPR/Cas9 5～6周，该系统能够在体内有效破坏心肌细胞中Ryr2突变等位基因，且接受AAV-CRISPR治疗的R176Q/+小鼠未出现心律失常[10]。对3月龄mdx小鼠尾静脉注射SERCA2a AAV9载体，阻止其扩张型心肌病的发展[11]。AAV9-Cas9-gE51处理DMDΔ52猪模型恢复其心脏抗肌营养不良蛋白的表达，延长其寿命，减少心律失常的易感性[12]。这些结果证实，通过AAV-CRISPR/Cas9传递系统进行体内基因编辑可能是治疗CVD的一种有效治疗方法，同时有可能改善药物的疗效。

3 CRISPR/Cas9技术的局限性

CRISPR/Cas9工具虽能缓解心血管疾病模型症状，但其也是一把双刃剑，高编辑效率成为其直接应用于人临床治疗的一大障碍，使其在整个基因组的脱靶位点均可能发生突变。HDR能够在基因组中引入特定的突变，然而HDR只在S期或G2期的增殖细胞中起作用，而NHEJ在细胞周期所有阶段不同类型的细胞都能发挥作用。因此目前运用CRISPR/Cas9技术通过HDR校正成熟的心脏和血管组织致病突变较为困难。

有望克服上述局限性的技术是体内单碱基编辑器的使用。单碱基编辑器是被修饰过的CRISPR/Cas9工具，能够改变单个碱基对而不发生DSB，如BE3仅能引起单链断裂，并与胞嘧啶脱氨酶结构域连接，该结构域能够在切口处将胞嘧啶转变为尿嘧啶。目前已有研究通过腺病毒载体分别将BE3递送入Pcsk9突变和ANGPTL3突变小鼠体内，结果发现，经治疗后小鼠血浆胆固醇水平显著下降[13,14]。然而单碱基编辑器仅限于点突变的产生，无法实现基因的敲除，而且较大的组分难以包装成病毒颗粒。

综上所述，CRISPR/Cas9技术已广泛应用于基因功能研究和多种动物疾病模型的构建，并且作为一种治疗手段，该技术在动物模型上的可行性和有效性也已被研究。虽然CRISPR/Cas9技术也有其不可避免的局限性，如脱靶问题较为严重，但是现如今世界科技水平日益增强，基因编辑技术的发展如此迅猛，相信不久的将来科研人员能够将现阶段基因编辑工具存在的缺陷逐步解决，未来能够直接应用于人类CVD的治疗。