环状RNA在乳腺癌中的研究进展

刘晶晶，周冬冬，张瑾

环状RNA（circular RNAs,circRNAs）于1976年通过电子显微镜在RNA病毒中首次被发现。随后，在真核生物中也清晰地观察到了circRNA的结构［1］。与线性RNA结构不同，circRNA是单链共价闭合环状结构，无5'帽端和3'尾端［2］。在过去的30年里，这些circRNA被认为是错误剪接或前体mRNA加工过程中的副产物。在不同的生物体中，也只有少量circRNA被发现［3］。然而，随着高通量测序技术的发展和广泛应用，以及针对circRNA检测和量化的特定方法的发展，circRNA作为一种新兴的非编码RNA被推到了聚光灯下，大量circRNA已被成功识别。研究表明circRNA广泛参与了细胞的生长、分化、发育和凋亡在内的病理生理过程，并与多种恶性肿瘤的发生、进展相关［4］。这为我们提供了肿瘤研究的新方向。

1 circRNA概述

1.1 circRNA分类及其形成机制 circRNA是一类不具有5'末端帽结构和3'末端polyA尾结构，并以共价键的形式形成环形结构的特殊RNA分子。具体来说，环状是借助套索结构或内含子的互补配对，以反向剪切的方式来形成的［5］。根据circRNA的来源可分为3类：外显子 circRNA（exonic circRNA，ecRNA）、内含子 circRNA（intronic circRNA，ciRNA）以及由外显子和内含子共同组成的circRNA（exonintron circular RNAs，EIciRNA）［6-7］。circRNA的产生机制较为复杂，主要有套索驱动的环化、内含子配对驱动的环化形成的外显子circRNA，内含子独立环化、内含子RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）或转录因子驱动的环化形成的内含子circRNA等机制［8］。目前circRNA的产生机制仍在不断探索中。

1.2 circRNA的特性

1.2.1 保守性 大多数circRNA中的一些序列在进化上是保守的。作为非编码RNA的一种，circRNA保留了相似的RNA结构。circRNA主要特点是以1个2'，5'-磷酸二酯键使首尾相连，而竞争性内源RNA（Competing endogenous RNA，ceRNA）则以1个3'，5'-磷酸二酯键连接首尾两端。这种特殊的反式剪接具有高度的保守性［9］。circRNA的保守核苷酸序列丰度明显增加。通过自身的miRNA应答元件（MicroRNA response element，MRE）竞争性结合同一miRNA，与其他具有MRE的ceRNA［假基因转录本、长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）和mRNA等］相比，circRNA因其特殊结构而具有的稳定性使其成为一种优势ceRNA［10］。

1.2.2 稳定性 多数circRNA可以在细胞质中稳定存在。这种稳定性可能是由于circRNA缺乏与mRNA类似的5'帽和3'尾端结构，从而避免了脱腺苷化、脱帽等降解反应［11］。

1.2.3 丰富性 circRNA在生物体中广泛存在和表达，也存在于人体多种体液中，如血浆［12］、唾液［13］以及外泌体等［14］。

1.2.4 特异性 不同细胞、组织在不同发育阶段具有circRNA特异表达谱，这种表达的特异性提示不同的circRNA具有特定功能。

1.3 circRNA的生物学功能 虽然关于circRNA参与调控生物学功能的机制尚不清楚，但越来越多的证据表明其参与了一系列的病理生理过程。

1.3.1 miRNA海绵样作用 CircRNA含有大量不同类型的miRNA反应元件，可以与miRNA相互作用，在细胞中充当miRNA海绵、消除miRNA对其靶基因的抑制作用，这种抑制能力称为miRNA海绵作用。CDR1as，即ciRS-7，包含70多个保守的结合位点，在人类和小鼠的大脑中高度表达，首次报道其功能即是作为miR-7的海绵发挥作用［9］。另外一种circRNA——Sry（sex-determining region Y）被报道可作为miR-138的海绵，从而调控肿瘤细胞的侵袭和转移［15］。以上研究结果表明，circRNA可以作为miRNA海绵参与肿瘤的调控。

1.3.2 circRNA与蛋白结合 CircRNA可以直接或通过RNA与蛋白质分子特异性结合，也可以作为竞争分子阻断蛋白质与靶分子的结合［16］。circRNA与蛋白质相互作用的一个例子是circFoxo3。CircFoxo3优先在细胞质中表达，可以与抗衰老蛋白质分化抑制因子1（Inhibitor of differentiation-1，ID1）、转录因子E2F1（E2F1基因编码的、与细胞周期相关的转录因子）和抗应激蛋白局部黏着斑激酶（Focal adhesion kinase，FAK）/HIF1α结合，导致结合体滞留在细胞质中，阻止ID1 E2F1-FAK/HIF1α的核易位，从而抑制心肌细胞的抗衰老和抗应激功能［17］。

1.3.3 circRNA调控基因转录 虽然大多数circRNA作为miRNA海绵调控miRNA，但也有一些circRNA可以顺式或反式调控基因转录。研究发现，细胞核内的circRNA被敲除后，其对microRNA靶点的富集减少，这也导致了它们的亲本基因表达减少；例如ci-ankrd52和ci-sirt7通过与PolⅡ相互作用，可以作为亲本基因转录的正向调控因子，这说明内含子circRNA可以调控亲本基因的转录［6］。

1.3.4 circRNA参与蛋白质的翻译 大多数研究人员认为circRNA是一类独特的内源性非编码RNA，不能翻译蛋白质。然而，考虑到大多数circRNA是由编码基因产生的，并且包含完整的外显子，一些circRNA被证明有潜力被翻译成蛋白质。研究人员在大肠杆菌中转染插入了绿色荧光蛋白开放阅读框的人工circRNA，可以使大肠杆菌产生极长的蛋白链［18］。此外，Legnini等［19］研究发现，circ-ZNF609可以翻译小鼠成肌细胞中的蛋白。总之，目前已有证据证明circRNA可以直接翻译蛋白质。

2 circRNA在乳腺癌中的研究进展

早期研究表明，circRNA在许多癌组织中均有差异表达，随着高通量测序技术的发展，包括乳腺癌在内的肿瘤组织中已发现大量circRNA，提示circRNA可能被应用于乳腺癌的诊断和治疗。

2.1 circRNA在乳腺癌中的表达 越来越多的证据表明，在正常乳腺组织中检测到的circRNA数量高于肿瘤组织。在最近的一项研究中，研究人员筛选了乳腺癌和邻近正常组织中的circRNA表达谱，circRNA微阵列分析结果显示，1 155个差异表达circRNA中715个上调，440个下调，证明了hsa_circ_103110、hsa_circ_104689和hsa_circ_104821水平在乳腺癌组织中升高，而hsa_circ_006054、hsa_circ_100219和hsa_circ_406697水平在乳腺癌组织中降低［20］。Nair等［21］开发了Circ-Seq工作流程，以识别乳腺肿瘤样本特异性的circRNA，并编制3种乳腺癌亚型中独特的circRNA：三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）、雌激素受体阳性（ER+）和ErbB2过表达HER2阳性（HER2+）乳腺癌；值得注意的是，与来自癌症基因组图谱（TCGA）的邻近正常乳腺组织以及来自基因型组织（GTEx）的正常乳腺组织样品相比，在乳腺肿瘤中观察到较少数量的circRNA表达；此外，此项研究还发现ER+乳腺癌癌旁正常组织中的circRNA与增殖基因的复发风险增殖（ROR-P）评分呈负相关，提示circRNA可能是乳腺癌和相关细胞增殖的标志物。

2.2 circRNA与乳腺癌的增殖和进展

2.2.1 circRNA通过microRNA海绵调节乳腺癌的增殖和进展 越来越多的证据证明，microRNA在肿瘤发生过程中调控基因表达。深入研究发现，部分circRNA作为microRNA海绵参与调控肿瘤的增殖、转移和侵袭。Tang等［22］研究发现circRNA hsa_circ_0001982在乳腺癌组织和细胞系中明显过表达，其通过靶向miR-143发挥竞争性内源性RNA（ceRNA）的作用；敲低hsa_circ_0001982可以抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭，并诱导细胞凋亡。该研究探讨了circRNA的ceRNA机制在乳腺癌发生发展中的作用，为基础研究提供了新的视角。

有研究报道，circGFRA1在乳腺癌中上调表达，并与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和组织学分级呈正相关；进一步的实验表明，circGFRA1可能作为miR-34a海绵通过ceRNA机制起到调节GFRA1表达的作用，从而促进细胞增殖，抑制TNBC的凋亡［23］。上述研究证明circRNA可通过miRNA海绵作用隔离与增殖相关的特定miRNA，从而调节肿瘤的发生、发展。

2.2.2 circRNA通过癌症相关的信号通路调节乳腺癌细胞的增殖和进展 乳腺癌细胞增殖与多种癌症相关信号通路的异常激活有关。研究表明，circRNA通过直接调控靶基因或与癌症相关信号通路密切相关的miRNA相互作用，在乳腺癌的发生、增殖、转移和侵袭过程中发挥重要作用。最近一项研究表明，hsa_circ_0011946/复 制 因 子 C3（Replication factor，RFC3）信号通路的失活可能抑制MCF-7细胞的迁移和侵袭能力［24］。miR-7作为一种抑癌miRNA，在乳腺癌组织中的表达低于正常乳腺组织，在侵袭性乳腺癌细胞系中过表达miR-7可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭［25］。目前，miR-7已被证实可通过直接下调表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）［26］、红系 Kruppel样因子（Kruppel like factor，KLF4）［27］、组蛋白甲基转移酶 SETDB1［28］等关键促癌因子的表达参与许多癌症相关的信号通路，这些研究表明miR-7具有明显的抑癌作用。Zhang等［28］证明miR-7通过直接抑制致癌基因SETDB1的表达，从而阻断STAT3信号通路，进而抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭，部分逆转MDA-MB-231乳腺癌细胞的上皮-间充质转化（Epithelialmesenchymal transition，EMT）；该研究还发现ciRS-7可能作为miR-7的竞争性circRNA减弱miR-7对STAT3通路的抑制。综上所述，新发现的ciRS-7作为一种抑制miR-7的circRNA，参与了许多癌症相关的信号通路。

2.3 circRNA与乳腺癌的诊断与预后 预后评估对预后不良因素的早期干预和癌症患者预期寿命的延长具有重要意义。近年来研究表明，circRNA参与了乳腺癌的多种病理过程。探索circRNA作为乳腺癌诊断和预后的生物标志物具有重要临床意义和价值。例如，乳腺癌患者术后血浆hsa_circ_0001785水平较术前明显降低，提示其可作为判断预后的生物标志物［29］。这种现象可能主要是由于乳腺癌切除后肿瘤源性核酸的释放减少引起的［30］。而且血浆中hsa_circ_0001785的水平还与乳腺癌的组织学分级、TNM分期及远处转移密切相关，从而利用has-circ-0001785在不同分期乳腺癌组织中表达水平的差异进一步对乳腺癌进行细化分期分级。此外，有报道称circGFRA1在乳腺癌组织中上调，与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和TNBC的组织学分级呈正相关［23］。以上研究证明circRNA在乳腺癌的诊断和预后方面具有较好的应用前景。

2.4 circRNA与乳腺癌化疗耐药的关系 circRNA不仅与乳腺癌的发生和发展有关，而且与乳腺癌化疗的不良反应及耐药产生也有着密切的联系。化疗是治疗乳腺癌的有效临床策略，但有时因为药物耐药导致疗效降低，从而导致乳腺癌患者治疗失败和较差的预后。探索化疗耐药产生机制中涉及的分子途径至关重要。例如，Gao等［31］在阿霉素耐药的MCF-7乳腺癌细胞系和其亲代细胞中筛选出了18个差异表达的circRNA，其中hsa_circ_00006528在阿霉素耐药细胞中的表达相对阿霉素敏感细胞系更高；此外，还进一步揭示了hsa_circ_00006528-miR-7-5p-Raf1反应轴在乳腺癌耐药相关机制中的作用，揭示了hsa_circ_00006528克服阿霉素耐药性的可能性。此外，Miao等［32］证明了 miR-130b 靶向PTEN通过PI3K/Akt信号通路诱导多药耐药；考虑到circRNA的生物学功能，某些circRNA可能充当miR-130b的海绵，与PI3K/Akt信号通路中相关靶基因作用参与乳腺癌的化疗耐药。鉴于circRNA与乳腺癌耐药的关系，分析circRNA的异常表达对于乳腺癌的进一步治疗至关重要。

2.5 circRNA与乳腺癌的靶向治疗 CircRNA具有潜在的抗癌作用，目前已有大量的circRNA被证实与乳腺癌的增殖和进展有关，显示了其作为乳腺癌治疗靶点的潜在作用。Wang等［33］研究表明，circRNA-000911在乳腺癌中通过对miR-449的海绵样作用，从而激活Notch1和核因子（NF）-κB信号通路，发挥其抑制肿瘤的作用。因此，circRNA-000911可能为乳腺癌的新治疗策略的制定提供了一个新的方向。此外，研究报道circ-Foxo3可诱导肿瘤细胞凋亡和抑制乳腺癌进展，因此其有望成为一种新的乳腺癌治疗靶点［34］。目前，研究表明肿瘤干细胞对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用［35］。传统治疗方法最终失败的原因可以归结为没有杀死肿瘤干细胞，最终导致肿瘤复发。为了预防乳腺癌的复发和转移，根除乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells BCSCs）至关重要。Yan 等［36］使用RNA测序技术筛选了BCSCs中的circRNA谱，发现27个circRNA表达异常，其中19个表达下调，8个表达上调，并且发现circVRK1可以抑制乳腺癌干细胞的扩张和自我更新能力。此项研究结果表明circVRK1可能是乳腺癌的一个治疗靶点。

目前，有几种技术为部分或完全去除致癌circRNA提供了前所未有的机会，包括基于siRNA的治疗［37］、反义寡核苷酸治疗［38］、CRISPER/Cas系统［39］等。相反，以往的研究表明，参与癌症的miRNA可以分为促癌miRNA和抑癌miRNA。前者可以通过miRNA海绵的功能或其他途径被circRNA所抑制。由于某些circRNA对特定的miRNA具有许多结合位点，因此它们比典型的miRNA抑制剂更有效。此外。有研究表明，细胞外囊泡很有可能可以有效地将circRNA传递到准确的作用位点［40］。

3 展望

circRNA曾被认为是mRNA错误剪接形成的副产物，现在被认为是RNA领域中一个新兴的关键分子。circRNA分子具有miRNA海绵样作用、调控转录和翻译、作为生物标志物以及抑癌因子等一系列功能，被认为是各种生理和病理生理过程中的重要调控因子。近年来，诸多研究探索了circRNA在癌症中的临床价值。本文介绍了circRNA参与乳腺癌的增殖、迁移、侵袭和凋亡等多种生物学过程，其作为在乳腺癌诊断、预后、复发和风险评估等方面有前景的生物标志物，是潜在的治疗靶点。总之，circRNA为乳腺癌的诊断和治疗提供了一个新的视角。然而，与编码RNA、miRNA和lncRNA相比，目前我们对circRNA的认识还比较浅显，大多数circRNA的生理和病理过程中的生物学功能还需要进一步的研究来揭示，以便在未来应用于临床。