miRNA 调控家畜肌肉组织生长发育的研究进展

冯紫婷 ，安清明，王大会，贺 花，李心语，文逸凡，雷初朝，陈 宏，黄永震*

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.铜仁学院农林工程与规划学院，贵州铜仁 554300；3.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100）

miRNA（microRNA）作为一类对生物体具有调控功能的非编码小分子RNA，在动植物细胞中均可广泛表达。经研究发现，miRNA 能够抑制其靶mRNA 的表达并进而调控动物相应的生理生化水平，因此认为它对动物机体具有重要的调节作用[1]。肌肉组织正常的生长发育是动物优良的生产价值和产品品质的保障。肌肉组织的生长在家畜胎儿时期主要依靠于肌纤维的增殖和分化，出生后凭借肌细胞体积的增大来维持一定水平的肌纤维数目[2]，而miRNA 的表达正是影响肌细胞生长发育过程的重要调控因素。miRNA 在肌肉组织中的表达可以分为肌肉特异性和非肌肉特异性。科学家把在肌肉中能够特异性表达的miRNA 归为myomi Rs 家族[3]，如miRNA-206、miRNA-133、miRNA-1 等均为肌肉特异性miRNA；miRNA-23a、miRNA-24 等不在肌肉组织中特异性表达，但它们对于家畜肌肉组织的作用也不容小觑[4]。本文对miRNA 在不同家畜肌肉细胞中的作用和调控机制做一论述，并对其在生产运用上的发展进行展望。

1 miRNA 研究背景及作用机制

历史上首个miRNA 是Lee 等[5]在线虫体内发现的，这种仅有22 个核苷酸的小分子RNA 可以通过与lin-4基因的3'UTR 碱基互补配对来抑制该基因的表达，从而致使相关蛋白质的合成减少；2000 年，let-7作为人类发现的第2 个miRNA 引发了研究者的关注[6]，let-7相似于lin-4，同样可以调节线虫的发育进程。自此，miRNA 调控机制的研究逐渐引起人们重视，且相继在线虫、果蝇、人类、小鼠、猪等物种中发现了数以千计的miRNA 基因。

随着研究的不断深入，miRNA 的形成机制也逐渐明朗：miRNA 最初是由miRNA 基因首先转录为一较大的前体pri-miRNA，然后再经RNase Ⅲ核酸酶的Drosha[7]和其他蛋白复合体将pri-miRNA 剪切为具有70 nt 的茎环发夹结构的pre-miRNA 形式，随后premiRNA 从细胞核转运进入胞质，再进一步被Dicer 酶裂解生成具有22 nt 的双链小分子，最后将其互补配对序列解链，形成最终产物miRNA。通过科学家不断的探究发现，miRNA 是通过由siRNA 与Argonaute 蛋白和Dicer 酶复合形成的RNA 诱导基因沉默复合物（RISC）的激活来抑制基因表达，其具有等调控模式[7]。在不同条件下，不同的miRNA 通过与之对应的Argonaute 蛋白组成miRISC，然后作用于其靶mRNA，进而调控基因的表达和蛋白的产生[7]。然而，也有研究者发现，miRNA 实际上是一类对基因表达量一般仅具有微调作用的RNA 分子，如Bartel 等[9]将miRNA 比作物理上的微型电阻，miRNA 根据自身与其靶基因的配对水平，发挥着从100% 抑制到微弱抑制的生物学效应，而在miRNA 家族中具有明显影响效应的（如lin-4、let-7）实际为数较少，更多起着微调的作用。

2 肌肉的形成机制

肌肉细胞主要是由胚胎时期的轴旁中胚层和侧中胚层分化而来，其中所有的骨骼肌都来自于轴旁中胚层的生肌节区，所有心肌和平滑肌都来自于侧中胚层。随着肌肉组织的不断发育，骨骼肌间质细胞从具有DNA 复制和细胞分裂的单核细胞逐渐分化为不具有复制能力的成肌细胞，之后肌细胞之间进一步发生融合形成肌管，随着肌细胞核从细胞中心向细胞边缘的移动以及肌原纤维数目的不断增加，最终肌管将成为肌纤维来作为肌肉组织生长发育的基本组成物质。在肌管阶段，还有部分单核细胞会分化为肌卫星细胞，用于肌肉损伤时的再生肌细胞。动物肌肉的生长发育过程主要依赖肌纤维的增殖、分化和凋亡功能来完成肌肉组织的形成。而肌纤维的生长又可分为出生前和出生后2 个时期：出生前动物肌肉的形成主要依靠肌细胞的增殖和细胞体积的扩大；出生后动物的肌纤维数目维持一定的水平基本保持不变，主要依靠肌细胞体积的增大和肌细胞的凋亡[10]来维持肌肉正常的生长发育。

3 miRNA 对家畜肌肉发育的调控

3.1 miRNA 对牛肌肉组织的调控 对于肉牛而言，肌肉组织的生长发育作为影响产肉量和牛肉品质的直接因素，一直是牛分子育种上的研究热点。miRNA 作为影响其生长发育的重要因素之一也逐渐走入研究者的视野。众所周知，阉公牛的肉质多汁、鲜美，其食用口感显著优于正常公牛，在市场上广受好评，因此探究造成这种差异的分子机制也成为了科学家的研究方向。夏广军[11]利用全基因组芯片和miRNA 芯片技术构建了公牛和去势公牛背最长肌差异表达基因库，并筛选出背最长肌中差异表达的miRNA，发现在被检测到的3 769 个miRNA 中有32 个存在差异表达，且其中有26 个miRNA 可关联到12 个差异表达的靶基因上，进一步佐证了miRNA 对肌肉组织发育具有调控作用；实验还利用GO 分析发现了多个基因及信号通路参与各种生物学过程及细胞组成等，但其具体作用机制还尚待考究。牛的生长主要可以分为胚胎期、哺乳期、幼年期、青年期以及成年期，不同生长时期的肌肉增长速度和方式也固然不同。孙加节[12]利用R 包edgeR 对755 个秦川牛出生前后共5 个时期的背部肌肉中miRNA 的表达情况进行了鉴定，结果显示miRNA 在5 个时期均有较高水平表达，但miRNA 在出生前表达种类丰富而出生后表达相对集中，说明miRNA 在肌肉组织中的表达具有时空特异性；研究还发现miRNA-10020 与miRNA-133 作用机制相似，可直接通过调控靶基因ANGPT1的表达水平从而抑制出生后肌卫星细胞的分化，维持肌纤维数目的恒定，但敲低miRNA-10020 的表达量对牛肌卫星细胞并未产生显著影响。这其中的原因及分子机制还需要进一步探索。CircRNA 作为一种分子海绵，可与miRNA 结合并调节其分子功能。魏雪锋[13]以秦川牛为实验对象，利用超表达及干扰手段，以高通量测序方法建立了circRNA-miRNA-mRNA 作用网络，结果发现circMLO7 可与miRNA-378a-3p 靶向结合并抑制其活性，解除它对HDAC4基因的抑制作用。HDAC4基因不仅可以通过基因转录的表观遗传调控，以细胞自主的方式促进卫星细胞的补充和分化，还能通过肌肉衍生可溶性因子影响肌源性细胞的生长，从而促进肌细胞的增殖，抑制肌细胞的分化[14]。并且miRNA-378a-3p在肌肉组织中表达量与其他类miRNA 相比具有显著优势，它的高表达量一方面可以下调细胞凋亡抑制因子的表达水平，上调凋亡诱导因子的表达水平，促进肌细胞的凋亡；另一方面又会上调肌肉分化因子的表达水平，起到促使肌管合成和肌细胞分化的作用。除此之外，该研究还发现miRNA-107 的生物学效应恰恰与miRNA-378a-3p 相反，高表达量的miRNA-107 可利用其靶基因Wnt3a来抑制肌细胞分化、促进肌细胞增殖[13]，这也可能成为今后牛的育种工作上新的分子标记方式。Tomasz 等[15]研究发现miRNA 在骨骼肌细胞中的表达情况还与品种有关，它们对海福特牛（HER）和利姆豪斯牛（LIM）的半腱肌进行肌源性分化，最终在两者的骨骼肌细胞中发现了4 个差异表达的myomiRs，且其在HER/LIM 原代培养物中的表达量显著高于对照组；细胞培养结果还显示miRNA-1 和miRNA-206 会促进肌肉的分化，而miRNA-133 则主要促进肌肉细胞的增殖，这也验证了Dai 等[16]发现miRNA-1 和miRNA-206 通过下调PAX7和HDAC4调控骨骼肌卫星细胞成肌分化的机制。

3.2 miRNA对羊肌肉组织的调控 miRNA-431、miRNA-433、miRNA-127、miRNA-434、miRNA-432 以及miRNA-136是首次在双肌臀羊肌肉细胞中被鉴定出来的几种miRNAs，这些成熟体的发现表明了miRNA 对羊的肌肉性状具有不可忽视的调控作用。miRNA-1 与miRNA-133 作为2 种最常见的调控肌肉组织生长发育的miRNA，其调控作用已在不同动物中被逐渐证实。王丽娟[17]对安徽白山羊和波尔山羊10 个不同组织中miRNA-1 和miRNA-133 的表达规律进行了研究，发现miRNA-1 和miRNA-133 可通过抑制其靶基因HDAC4和SRF的翻译即抑制其转录后表达来降低HDAC4 和SRF 蛋白的表达，从而调节骨骼肌细胞的发育状态。此外，宋广超[18]检测miRNA-133 在4 个不同绵羊品种中的表达多态性，发现其前体物中存在GG 基因型可显著提高miRNA-133 的表达水平，即可促进骨骼肌细胞的增殖，可以通过基因突变来调控肌肉发育情况。近些年，肌细胞的生长发育具有时空特异性这一现象也逐渐在各种羊的肌肉组织中被证实。王艳红[19]对徐淮山羊90 d 的羔羊和6 个月龄成年羊肌肉组织的小RNA 库进行了测序，发现二者肌肉组织中的小RNA 组成差异显著，即存在时空特异性，但实验并未详细说明这其中miRNA 所占的比例及差异情况，所以无法有力验证miRNA 在该山羊肌肉组织中是否存在时空特异性；实验通过对相应的转录组谱进行整合分析，在2 个发育阶段肌肉组织中筛选出了12 个对肌肉发育可能具备重要作用的miRNA，其中miRNA-424-5p 被发现对C2C12细胞（成肌细胞）具有促进分化的作用。杨灵芝[20]以湖羊为研究对象，不仅验证了miRNA 在其肌肉组织中表达的时空特异性，还发现在胸肌组织中具有高表达量的miRNA-452 可以通过靶基因ANGPT1来促进成肌细胞的增殖并抑制其分化，这为湖羊的品种改良提供了新思路和新方法。为进一步探寻不同羊品种miRNA 表达的时空特异性，张伟等[21]利用Solexa 测序技术检测到了有385 个miRNA 在巴什拜羊出生前后具有上调或下调的差异表达，可以推测这些miRNA 对巴什拜羊肌肉的发育状态和品质可能存在着重要的调控机制，其中也不排除miRNA-1、miRNA-133 和miRNA-206 等在骨骼肌各个生长阶段都具备重要调控作用，这些miRNA在出生前后的表达量变化小，维持着相对稳定的表达水平，对绵羊肌肉组织的发育同样具有重要意义。

3.3 miRNA 对猪肌肉组织的调控 经研究者发现，猪肌肉细胞的miRNA-133 和miRNA-1 位于同一条染色体上，且在心肌和骨骼肌细胞中都具有表达特异性[22]，其中miRNA-1 可以促进猪肌肉的分化成熟且抑制其增殖，而miRNA-133 与其作用完全相反，二者相辅相成共同调节肌肉的生长。为了揭示miRNA 在不同品种猪肌肉组织中的表达差异情况，Tang 等[23]研究发现，肌特异性miRNA-133b 和miRNA-206 在长白猪、通城猪和五指山猪产前骨骼肌中的表达模式不同，表达量达到峰值的时期也存在较大差异，表明相同miRNA 在不同猪品种中会发挥出不同的表达方式及调控机制。Zhu 等[24]研究发现，miRNA-199b 对长白猪的肌卫星细胞的增殖具有抑制作用，而其靶基因JAG1对猪肌纤维细胞的增殖具有促进作用，所以miRNA-199b 的调控机制是通过对JAG1基因的负调控来对猪肌卫星细胞发挥作用；实验还发现当JAG1基因过表达时会促进miRNA-199b的产生，即其过程具有负反馈作用，推测这可能是为了维持猪肌卫星细胞增殖水平的稳定，避免增殖过度情况的发生，但具体机制还有待对JAG1 上调miRNA-199b表达做进一步研究。梅山猪的体重一般均低于野生型梅山猪，Xie 等[25]通过对肌生长抑制素（MSTN）功能缺失的梅山猪（MKO）和野生型梅山猪（MWT）进行生物学测序，发现MKO 与MWT 相比有4 个miRNA 显著上调，5 个miRNA 显著下调，且GO 分析显示这些miRNA 的靶基因在肌肉生长、肌纤维形成等生物学过程上富集，表明这些miRNA 可能直接参与猪骨骼肌细胞的分化和肥大，从而造成了体重增加，但其具体作用机理还尚不清楚，仍需后续进行相关研究对此进行验证。

4 应用与展望

miRNA 作为动物体内重要的调控分子之一而备受研究者关注。随着研究的不断深入，越来越多的miRNA 被发现在家畜肌肉组织中差异表达，它通过与相应的靶基因结合，经过Wnt 等信号通路来促进或抑制肌细胞的增殖、分化以及凋亡等生命过程。因此，探究miRNA 对肌肉的正确调控机制对肉制品的改良和畜牧业的发展具有重要意义。然而截至目前为止，关于miRNA 对其靶基因以及生物学效应的具体作用机制还处于不明确的状态，miRNA 对家畜肌肉组织的调控具有时空差异性的原因也尚未揭晓。随着科学技术发展及科研深入，利用miRNA 的调控作用来提高家畜的产肉量和肉品质，将为我国畜牧生产的发展提供新思路和新方法。