组蛋白去乙酰化酶抑制剂对牛羊体细胞核移植影响的研究进展

李 飒，房晓欢，张效生，张金龙，孙树春,3*，李俊杰,3*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000；2.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；3.河北省牛羊胚胎技术创新中心，河北保定 071000）

体细胞核移植（SCNT）是一项重要的动物细胞工程技术，可应用于转基因动物制备、疾病模型构建、动物遗传多样性保存及濒危哺乳动物繁殖等多种领域，但SCNT 效率较低，仅为1%～5%，阻碍了该技术的广泛应用[1]。目前认为供体细胞或重构胚重编程不完全与克隆动物成功率低存在密切联系[2]。组蛋白乙酰化是表观遗传重编程的重要调节机制之一，与克隆胚胎的发育密切相关。研究发现，SCNT 胚胎中组蛋白乙酰化水平普遍较低，提高组蛋白乙酰化水平可提高重编程效率[3]。近年来，有关组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）对供体细胞重编程和SCNT 胚胎发育的促进作用得到越来越多证实。在对牛羊供体细胞的影响方面，Cao等[4]研究发现HDACi 处理羊供体细胞使G0/G1 期细胞所占比例上升，有利于SCNT 胚胎发育，并可提高H4K12、H3K9 乙酰化水平；Li 等[5]研究发现HDACi处理牛供体细胞后，可影响组蛋白甲基化H3K4me3、H3K9me2 位点的表达，促进克隆胚胎发育；在重构胚方面，众多研究表明HDACi 对重构胚的早期发育、表观遗传修饰、染色质结构及多能基因表达、细胞凋亡等方面有重要影响[6-8]。本文主要针对HDACi 对牛羊SCNT 的影响进行综述，为提高牛羊的体细胞克隆胚胎生产效率提供参考。

1 HDACi 的作用及分类

HDACi 是一类蛋白酶抑制剂，通过干扰组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的功能从而在染色体重塑、基因的表达调控等方面发挥重要作用。目前HDACi 在治疗癌症和许多其他疾病以及提高克隆胚胎的重编程效率上得到广泛研究。HDACi 按结构可分为五大类：①异羟肟酸类，代表药物有曲古抑菌素A（TSA）、Scriptaid（SCR）、伏立诺他（SAHA）、CBHA；②短链脂肪酸类，如丙戊酸（VPA）、丁酸钠（SB）；③苯甲酰胺类，如西达本胺；④环状四肽类，如天然产物缩酚酸肽FK-228；⑤Sirt 抑制剂，如Sirtinol 和Salermide。受HDACi 种类、处理浓度及作用时间的影响，作用效果会产生很大差异，因此高效HDACi 的发现和处理条件的优化非常关键[8-9]。在牛羊SCNT 上应用的HDACi主要为VPA、TSA、SCR、CBHA 及SAHA。

2 HDACi 对牛羊供体细胞的影响

2.1 HDACi 对供体细胞周期的影响 供体细胞的细胞周期对体细胞克隆的成败至关重要。S 期的细胞染色体为非整倍性，处于DNA 合成期，使用S 期细胞作为供体细胞进行核移植得到的胚胎常常为畸形，因此S 期细胞不宜用于体细胞克隆，而是将处于G0/G1 期的细胞作为供体[10]。研究显示，对供体细胞进行饥饿处理或诱导处理使细胞至G0/G1 期，核移植效率明显高于未处理的供体细胞[11]。高海霞等[12]用0.8、1.0、2.0 mmol/L VPA 处理牛供体细胞24、48、72 h 后，发现G0/G1 期细胞极显著增加，S 期和G2/M 期细胞极显著减少，并具有明显的时间和剂量依赖性，随处理时间或剂量的增加G0/G1 期细胞比例增加。有研究表明，50 nmol/L TSA 处理牛供体细胞24 h 后，与VPA 的作用效果相似，可使牛供体细胞处于G0/G1 期[13]。Cao 等[4]使用0.2 μmol/L SCR 处理羊供体细胞24 h 使G0/G1 期细胞所占比例升高，促进了体细胞克隆胚胎的发育。因此，HDACi 可通过调节供体细胞周期提高克隆效率。

2.2 HDACi 对供体细胞组蛋白乙酰化水平的影响 组蛋白乙酰化/去乙酰化是由组蛋白乙酰基转移酶（HATs）和HDACs 共同催化完成，HATs 与HDACs 之间的动态平衡可调控染色质的结构。HDACi 主要通过干扰HDACs 的活性发挥作用。Luo 等[8]研究表明，用0.15～0.6 μmol/L TSA 处理牛供体细胞48 h 后，主要影响HDAC1的表达，对供体细胞中HAT1的表达无影响；Selokar 等[14]研究发现，当2.5～10 mmol/L VPA 处理牛供体细胞24 h 后，HDAC1表达下降，而对HDAC2的表达无影响；使用16 μmol/L SAHA 处理羊脂肪间充质干细胞24 h 发现，SAHA 能显著提高HDAC1和HDAC6的表达，降低SIRT1的表达[15]。

当HDACs 活性受到抑制，HATs 将乙酰辅酶A 的乙酰基转移到组蛋白氨基端特定的赖氨酸残基上，使组蛋白发生乙酰化。阮秋燕等[16]研究发现，0.25、0.5、0.75 μmol/L SCR 处理水牛胎儿成纤维细胞24 h 后可使其acH4K18 显著提高；而Cao 等[4]用0.2 μmol/L SCR处理绵羊卵丘细胞24 h 作用于H4K12、H3K9 位点，提高了卵丘细胞acH4K12、acH3K9 水平；Agrawal 等[6]用2.5～20 μmol/L CBHA 处理牛供体细胞24 h 后可提高acH3K9 水平，但不影响acH3K27 水平。同样，16 μmol/L SAHA 处理阿尔巴白绒山羊脂肪间充质干细胞24 h，也可提高acH3K9 水平，影响SCNT 胚胎发育[17]。因此，HDACi 能促进供体细胞不同组蛋白位点呈现高水平的乙酰化状态，有助于核移植后重编程，促进胚胎发育。

2.3 HDACi 对供体细胞组蛋白甲基化水平的影响 组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，发生于精氨酸和赖氨酸的侧链，由组蛋白甲基转移酶催化，可诱导染色质结构的改变。组蛋白甲基化修饰包括组蛋白一甲基化修饰（me1）、二甲基化修饰（me2）和三甲基化修饰（me3），其中，H3K9 的二甲基化和三甲基化修饰可影响基因沉默，H3K4 的甲基化修饰与基因转录起始有关。研究证明使用0.1 μmol/L TSA和0.5 μmol/L SCR分别处理牛供体细胞14 h，可使H3K9me3 水平显著降低，但不影响H3K9me2 的表达水平[18]。Li 等[5]在研究中发现0.25～1.0 mmol/L VPA处理牛成纤维细胞24 h后，其供体细胞H3K4me3 水平随VPA 处理浓度的增加而提高，H3K9me2 水平则随VPA 浓度的增加显著降低，有助于基因的表达与转录。可见，HDACi 可通过调节组蛋白甲基化水平调节染色体结构，提高SCNT 效率。

3 HDACi 对SCNT 胚胎早期发育的影响

3.1 HDACi 处理供体细胞对SCNT 胚胎早期发育的影响 利用HDACi 处理供体细胞后对SCNT 胚胎早期发育进行研究，Luo 等[8]发现用0.15、0.3 μmol/L TSA 处理牛供体细胞48 h 可使SCNT 胚胎的卵裂率和囊胚率显著提高；李俊杰等[19]用0.4 μmol/L TSA 处理山羊卵丘细胞19 h 后得到相同结果。但TSA 本身有致畸作用，高浓度TSA 处理供体细胞或作用时间过长都将显著降低核移植胚胎的体外发育能力[9]。SCR 毒性较TSA 低，且具有较高的组蛋白乙酰化活性。Cao 等[4]用0.2 μmol/L SCR 处理羊卵丘细胞24 h，显著提高了SCNT 胚胎的囊胚率。Sangalli 等[20]用0.2 mmol/L VPA 处理牛成纤维细胞24 h 后，重构胚组蛋白乙酰化水平、囊胚率均未提高，克隆牛胚胎植入前和植入后的发育情况也未改善。Selokar 等[21]虽证实1.5、3.0、4.5 mmol/L VPA 处理24 h 可改变水牛供体细胞组蛋白乙酰化和基因表达，但未改善克隆胚胎的体外发育能力，推测此结果的产生与供体细胞来源有关。总之，不同HDACi 处理供体细胞对于提高SCNT 效率和胚胎品质的作用不同。

3.2 HDACi 处理重构胚对SCNT 胚胎早期发育的影响当用3 mmol/L VPA 处理牛重构胚24 h 时，效果显著，可增加其囊胚率，大大提高牛囊胚形成速度、内胚层和滋养层的细胞数量、细胞存活率，并显著降低囊胚细胞凋亡[7]。Wen 等[22]用TSA 和SCR 处理羊重构胚24 h，对比对照组的克隆效率发现0.2 μmol/L SCR 的囊胚发育率较高，几乎是未处理组的2 倍，且0.2 μmol/L SCR比0.05 μmol/L TSA 对提高体外克隆绵羊胚胎的囊胚率更有效。曹慧等[23]用0.1 μmol/L TSA 和0.4 μmol/L SCR处理牛重构胚12 h，均可显著提高囊胚率，同样，SCR处理效果优于TSA。Zhang 等[24]研究发现，分别使用0.02 μmol/L和0.2 μmol/L的TSA和SCR处理牛孤雄胚胎15 h，可显著提高其桑椹胚率和囊胚率。Agrawal 等[25]用10 μmol/L CBHA 处理牛重构胚10 h，囊胚率明显提高，囊胚凋亡指数降低，提高了SCNT 效率。总之，HDACi 有利于SCNT 胚胎的早期发育，可用于提高其体外生产效率。

4 HDACi 提高SCNT 早期发育的机制

4.1 HDACi 对重构胚表观遗传修饰的影响 表观遗传修饰主要发生在胚胎发育的早期阶段，并与其发育潜能有关，因此这些表观遗传标记可用来预测SCNT 效率。Luo 等[8]研究表明，0.3 μmol/L TSA 处理牛供体细胞48 h 后提高了重构胚八细胞阶段H4K8 的乙酰化，达到与体外受精（IVF）胚胎同阶段相似水平。而Selokar等[14]使用2.5～10 mmol/L VPA处理牛供体细胞24 h后，其克隆囊胚中H3K9me3 水平显著低于未经处理的克隆胚胎，并使表观遗传状态更接近IVF 胚胎。Cao 等[4]研究发现，0.2 μmol/L SCR 处理羊供体细胞24 h 后，SCNT 胚胎中acH4K12 水平显著提高。Wen 等[22]使用0.2 μmol/L SCR 处理羊重构胚24 h 后发现，重构胚中除acH4K12 外，acH3K9 水平也有显著提高。因此，HDACi 在一定程度上对SCNT 胚胎的表观遗传重编程异常有修复作用，可使SCNT 胚胎的表观遗传修饰水平更接近IVF 胚胎。

4.2 HDACi 对染色质结构及重构胚多潜能基因表达的影响 HDACi 促进组蛋白乙酰化，间接导致染色质构型的改变，染色质重塑对基因表达十分重要，疏松型染色质可以促进基因的表达。Tóth 等[26]研究发现，TSA 可以诱导间期染色质发生去凝缩作用，使染色质长度从200 nm 延伸到1 μm。Li 等[27]通过基因表达间接观察TSA 对染色质结构的作用，发现染色质的构型发生改变，由紧密型变为疏松型。

多潜能基因OCT4、NANOG、CDX2和SOX2是哺乳动物早期胚胎中重要的转录调控因子，在胚胎发育早期起关键作用。研究表明，使用0.5 mmol/L VPA 处理重构胚24 h 可过表达OCT4和NANOG[5]；用10 μmol/L CBHA 处理牛克隆胚胎10 h 后也可促进OCT4和NANOG的表达[25]。Iager 等[28]使用50 nmol/L TSA 处理牛重构胚13 h 后，NANOG和CDX2表达量显著上调，且高于IVF 胚胎。魏丽晓等[29]研究发现，2.5 μmol/L SAHA处理山羊胎儿成纤维细胞24 h 后，克隆胚胎中囊胚的OCT4、SOX2、NANOG表达水平均显著高于未处理囊胚。因此，HDACi 能使染色质结构重塑并对多潜能基因的表达有显著影响。

4.3 HDACi 对重构胚凋亡的影响 SCNT 胚胎细胞凋亡是影响胚胎质量的关键因素。研究表明用2.5～10 mmol/L VPA 处理牛供体细胞24 h 后可抑制牛SCNT 囊胚细胞的凋亡，提高囊胚质量[14]。Cui 等[30]研究发现0.05 μmol/L TSA 处理牛重构胚10 h 后可调节凋亡相关基因表达，上调抗凋亡基因Bcl-xL表达，下调促凋亡基因Bax表达。并且，TSA 处理可影响重构胚中miRNA 的表达，SCNT 胚胎中miRNA-21 表达量低于IVF 胚胎，而TSA 处理可使其表达量增加，增强细胞的抗凋亡能力，从而促进牛克隆胚胎的发育[30]。内质网应激（ERS）在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。ERS 过强或持续时间过长会导致内质网稳态严重失衡，无法修复，引起细胞凋亡。Song 等[7]研究发现在衣霉素诱导的ERS 条件下，使用3 mmol/L VPA 处理牛重构胚24 h 可显著降低SCNT 胚胎ERS 相关信号分子sXBP-1和CHOP的转录水平，并显著提高抗凋亡蛋白GRP78/BiP 的表达水平，保护细胞免受ERS 介导的细胞凋亡影响。可见，HDACi 处理可抑制细胞凋亡，促进胚胎的进一步发育。

5 总结及展望

HDACi 作为一类组蛋白去乙酰化酶抑制剂，在克隆胚胎的表观遗传改变及发育方面具有积极作用。但由于HDACi 种类繁多及处理效果受时间、浓度等多因素影响，因此开发高效HDACi 和优化处理条件，对提高重编程效率、促进胚胎发育至关重要。此外，HDACi的作用机制及克隆胚胎移植后出生胎儿能否正常生长、发育仍需要进一步探讨。