植物乳杆菌发酵强化贝母-雪梨汁抗氧化性能的研究

刘金龙 ，危晶晶，白敬，赵国群，王勇，孙旭，关军锋

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050000）

乳酸菌发酵果汁，又称水果酵素，是一种利用乳酸菌发酵鲜果而成的饮品。乳酸菌发酵果汁过程中产生的有机酸、醛类、醇类和羧酸类等芳香成分，可改善其口感风味[1]，且有文献表明：乳酸菌发酵可促进植物细胞壁降解[2-4]，有利于细胞中有效成分如抗氧化物质的释放，增强果汁益生功能。

雪梨含有丰富的酚类物质[5]，表现出良好的抗炎及抗氧化活性[6-7]。雪梨制品，如雪梨膏、雪梨浆等，具有清咽润喉的功能[8]。贝母含有多酚[9]、黄酮等多种抗氧化成分[10]，具有清热润肺，化痰止咳等功效[11]。人们常将贝母与雪梨组合食用，强化其益生功能，如：“贝母炖梨”、“贝母蒸梨”、“鲜梨贝母汤”等。

本研究将贝母、雪梨汁二者组合，并添加植物乳杆菌对其进行发酵，研究了发酵过程中影响抗氧化物质多酚、黄酮释放的主要因素，并基于正交试验对其工艺进行优化，开发出一种具有优良抗氧化性能[12-14]的新型功能性饮品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌Zw-1：河北省发酵工程技术研究中心保藏菌株；雪花梨：河北省赵县；贝母：市售。

1.2 主要试剂

蛋白胨（BR）、牛肉膏（BR）、酵母浸粉（BR）、柠檬酸三铵（AR）、亚硝酸钠（AR）、硝酸铝（AR）、氢氧化钠（AR）：北京奥博星生物技术公司；葡萄糖（AR）、乙酸钠（AR）、磷酸氢二钾（AR）、碳酸钠（AR）、铁氰化钾（AR）、三氯乙酸（AR）：天津市永大化学试剂有限公司；吐温80（AR）：上海源叶生物科技有限公司；硫酸镁（AR）、硫酸锰（AR）、无水乙醇（AR）：天津市北方天医化学试剂厂；蔗糖：市售。

1.3 培养基

1.3.1 种子培养基

蛋白胨1.0 g，牛肉膏1.0 g，酵母浸粉0.5 g，葡萄糖2.0 g，柠檬酸三铵 0.2 g，吐温 80 0.1 mL，乙酸钠 0.5 g，磷酸氢二钾0.2 g，硫酸镁0.042 g，硫酸锰0.025 g，调pH值为6.8～7.0，蒸馏水定容至100 mL。121℃灭菌20 min。

1.3.2 基础发酵培养基

优良雪花梨梨汁100 mL，贝母粉（过40目筛）3 g，蔗糖15g。于85℃水浴灭菌30min，迅速冷却至40℃。

1.4 方法

1.4.1 种子培养

取斜面保藏的植物乳杆菌Zw-1一环，接种于100 mL种子培养基，36℃恒温培养12 h至对数生长期。

1.4.2 发酵培养

取5mL种子培养液，接种于基础发酵培养基，36℃恒温培养51 h。

1.4.3 样品制备

发酵贝母-雪梨汁与对比样品（贝母-雪梨汁和梨汁）的制备。

发酵贝母-雪梨汁：取100 mL雪梨汁，加贝母3 g，蔗糖15 g，于85℃水浴灭菌30 min，迅速冷却至40℃，接入3%种子培养液，于36℃恒温培养51 h；贝母-雪梨汁制备：取100 mL雪梨汁，加贝母3 g，蔗糖15 g，于85℃水浴灭菌30 min，迅速冷却至40℃，于36℃恒温培养51 h；梨汁制备：取100 mL雪梨汁，加蔗糖15 g，于85℃水浴灭菌30 min，迅速冷却至40℃。于36℃恒温培养51 h。

1.4.4 发酵工艺条件的单因素试验

1.4.4.1 植物乳杆菌接种量对贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响

取基础发酵培养基100 mL，以种子培养液接种量为变量，设置接种量分别为1%、3%、5%、7%、9%，于36℃发酵培养51h。取上层清液，测定其多酚、黄酮含量。

1.4.4.2 贝母添加量对贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响

取基础发酵培养基100 mL，以贝母粉添加量为变量，设置梯度为 1、2、3、4、5 g，于 36 ℃发酵培养 51 h。取上层清液，测定其多酚、黄酮含量。

1.4.4.3 蔗糖添加量对贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响

取基础发酵培养基100 mL，以蔗糖添加量为变量，设置梯度为 5、10、15、20、25 g，于 36 ℃发酵培养51 h。取上层清液，测定其多酚、黄酮含量。

1.4.4.4 发酵时间对贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响

取基础发酵培养基100mL，于36℃进行发酵培养，以发酵时间为变量，设置梯度为 31、36、41、46、51 h 。取上层清液，测定其多酚、黄酮含量。

1.4.5 贝母-雪梨汁正交优化试验

以多酚、黄酮释放量为指标，选择贝母添加量、发酵时间、植物乳杆菌接种量、蔗糖添加量为单因素，进行四因素三水平L9（34）正交试验，见表1。

1.5 多酚、黄酮含量测定及抗氧化性能检测方法

1.5.1 多酚浓度的测定

采用Folin-Ciocalteu比色法。取1mL样品于25mL比色管中，加入5 mL蒸馏水，1 mL显色剂和3 mL 75%碳酸钠溶液，摇匀，显色2 h。以蒸馏水代替样品作为空白对照。在765 nm波长下测定吸光度值，计算多酚浓度。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

1.5.2 黄酮浓度的测定

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法。取1 mL样品于10 mL容量瓶，依次加入4 mL 70%乙醇和0.3 mL 5%NaNO2溶液，静置6min。加入0.3mL10%Al（NO3）3静置6 min。再加入4 mL 4%NaOH溶液，静置10 min，用70%乙醇定容。以70%乙醇代替样品作为空白对照。在510 nm波长下测定吸光度值，计算黄酮浓度。

1.5.3 还原力的测定-普鲁士蓝法

取样品1 mL于试管中，加入2.0 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.6）和1%铁氰化钾溶液混匀，50℃水浴反应20 min后迅速冷却至25℃，立即加入2.0 mL 10%三氯乙酸终止反应。5 000 r/min离心10 min，吸取上清液2.0 mL，加入2.0 mL蒸馏水和0.4 mL 0.1%FeCl3溶液，混匀，暗室静置反应30 min，于700 nm波长处测定吸光度值[15]。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌发酵贝母-雪梨汁促进多酚、黄酮的释放

植物乳杆菌发酵贝母-雪梨汁，有利于促进多酚、黄酮的释放，如图1所示。

由图1可知，与贝母-雪梨汁相比，植物乳杆菌发酵后的贝母-雪梨汁中多酚、黄酮含量分别增加了25.71%和16.62%，与雪梨汁相比，贝母-雪梨汁复合物中多酚、黄酮含量也分别提高了17.37%和9.89%。且发酵贝母-雪梨汁、贝母-雪梨汁与雪梨汁中多酚、黄酮含量对比差异显著（P<0.05）。分析其原因可能为：在长时间的浸泡过程中，贝母细胞中的多酚、黄酮等有效成分借助于渗透和扩散作用，逐渐释放到梨汁中，使得梨汁中多酚、黄酮含量升高。当利用植物乳杆菌对贝母-雪梨汁进行发酵时，植物乳杆菌可能分泌一些有利于贝母细胞壁降解的酶系，提高贝母胞内物质的释放效率，从而进一步提高贝母-雪梨汁中多酚、黄酮的含量。

图1 不同雪梨汁样品多酚、黄酮含量比较Fig.1 Comparison of polyphenols and flavonoids in different pear juice samples

2.2 发酵贝母-雪梨汁与贝母-雪梨汁、梨汁的抗氧化性能比较

将发酵贝母-雪梨汁、贝母-雪梨汁和梨汁进行梯度稀释，稀释后浓度分别为样品的 1/2、1/4、1/5、1/8和1/10，原样品浓度设为1，稀释浓度以0.1、0.125、0.2、0.25、0.5表示，纵坐标为吸光度值。各样品Fe3+还原力测定结果见图2。

图2 不同雪梨汁样品Fe3+还原力测定结果比较Fig.2 Comparison of Fe3+reducing power determination results of different pear juice samples

研究证实，活性成分的抗氧化性能与还原力密切相关，即还原力越强，抗氧化活性越强。由图2可知，发酵贝母-雪梨汁、贝母-雪梨汁与雪梨汁3种样品的还原活性，均随样品浓度的增大而增大。更重要的是，与浸泡相比，贝母-雪梨汁经植物乳杆菌发酵后，可显著提高其还原活性，且浓度越高差异越明显。

李伟伟等[16]研究发现益生菌发酵可降低膳食纤维粒径，使其内部结构由原来致密的网状结构变得蓬松易碎；发酵亦能显著降低不溶性膳食纤维含量，增加可溶性膳食纤维含量。本试验乳酸菌在以植物类中药为基质进行发酵培养时，可能产生相应的物质定向作用于中药细胞壁，促进胞内有效成分的释放。由此可知，当将植物乳杆菌用于贝母-雪梨汁发酵培养时，该菌极有可能基于贝母细胞壁成分产生相应的复合降解酶系，加速贝母细胞壁破损过程，促进贝母胞内多酚、黄酮等有效成分的释放，从而表现出更强的抗氧化活性。

2.3 植物乳杆菌发酵贝母-雪梨汁单因素及正交试验优化

为进一步提高植物乳杆菌发酵对贝母-雪梨汁抗氧化性能的强化作用，本文分别考察了植物乳杆菌接种量、贝母添加量、蔗糖添加量和发酵时间等因素对贝母-雪梨汁多酚和黄酮释放量的影响。在此基础上，以贝母-雪梨汁多酚和黄酮释放量为指标，基于四因素三水平的正交优化试验结果，获得植物乳杆菌发酵贝母-雪梨汁的最佳工艺条件。

2.3.1 植物乳杆菌发酵贝母-雪梨汁单因素试验

2.3.1.1 植物乳杆菌接种量对贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响

植物乳杆菌接种量对贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响见图3。

图3 植物乳杆菌接种量对贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响Fig.3 Effect of Lactobacillus plantarum inoculum on the release of polyphenols and flavonoids in fritillaria-pear juice

如图3所示，在初始接种量较低时，随乳杆菌接种量的增加，贝母-梨汁发酵液中多酚和黄酮含量随之增加；当接种量为5%左右时，多酚、黄酮的含量均达到最大值；当接种量超过5%时，多酚、黄酮含量明显下降，其中黄酮含量下降尤为明显。由此可知，乳杆菌接种量将直接影响贝母-梨汁发酵液中多酚和黄酮的含量。当乳杆菌接种量过低时，发酵过程中植物乳杆菌活菌数过少，分泌到发酵体系中的破壁酶系较少，贝母细胞壁降解不彻底，导致细胞内多酚、黄酮等有效成分不能充分释放。当乳杆菌接种量过高时，发酵体系中含有较多的植物乳杆菌活菌，一方面发酵体系中的营养物质用于满足菌种自生生长所需，导致相关酶系合成不足，从而影响贝母细胞中多酚、黄酮等有效成分的释放；另一方面，发酵体系中的多酚、黄酮类物质可能被植物乳杆菌作为营养物质消耗掉，导致体系中多酚、黄酮类物质含量降低。因此，植物乳杆菌发酵贝母-雪梨汁时，以5%接种量为最佳。

2.3.1.2 贝母添加量对发酵贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响

贝母和雪梨汁作为主要发酵基质，其配比对发酵过程中多酚、黄酮释放量也有重要影响。本试验以贝母添加量为变量，研究贝母与雪梨汁不同配比对发酵过程中多酚、黄酮释放量的影响结果见图4。

图4 贝母添加量对贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响Fig.4 Effect of fritillaria addition on the release of polyphenol and flavonoids from fritillaria-pear juice

如图4所示，当贝母添加量小于0.3 g/L时，多酚、黄酮的含量随贝母添加量的增加而显著增加；当贝母添加量超过0.3 g/L时，多酚、黄酮的含量则不再上升，整体趋于平衡。这一现象可能是由于在固定的发酵时间内，植物乳杆菌的浓度和分泌产生胞外酶量逐渐趋于饱和，因而多酚、黄酮释放量不会随发酵基质含量的增加而持续增加。因此，当贝母添加量为0.3 g/L时，发酵体系中多酚、黄酮的含量达到最优值。

2.3.1.3 蔗糖添加量对发酵贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响

蔗糖既可作为植物乳杆菌发酵的碳源，也可改善发酵贝母-雪梨汁的口感，因此，在贝母-雪梨汁发酵体系中以蔗糖作为添加物。蔗糖添加量对发酵贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响见图5。

图5 蔗糖添加量对贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响Fig.5 Effect of sucrose addition on polyphenol and flavonoids release in fritillaria-pear juice

如图5所示，发酵液中多酚、黄酮含量随蔗糖添加量的增加，呈现先增加后减小的变化，当蔗糖添加量为15%时，发酵液中多酚、黄酮含量达到最大值。分析其原因可能为：当蔗糖含量过低时，发酵体系中乳杆菌数量较少，分泌产生的降解酶系亦较少。当蔗糖浓度过高时，抑制了植物乳杆菌的正常生长和胞外蛋白酶的分泌，导致贝母细胞破壁效果差，限制了多酚、黄酮等有效成分的释放。

2.3.1.4 发酵时间对贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响

植物乳杆菌的生长发酵受时间以及发酵周期的影响。发酵时间对贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响见图6。

图6 发酵时间对贝母-雪梨汁多酚、黄酮释放量的影响Fig.6 Effect of fermentation time on the release of polyphenols and flavonoids in fritillaria-pear juice

如图6所示，与上述3种单因素影响不同，植物乳杆菌发酵时间对贝母-雪梨汁中多酚和黄酮释放量影响并不完全一致。尽管多酚和黄酮释放量随发酵时间呈现先增加后减少的变化曲线，但发酵体系中黄酮含量在41 h时达到最大值，随后急剧下降，而多酚含量在46 h时达到最大值，滞后于黄酮含量峰值的出现时间。这一现象可能受多酚、黄酮分子量大小的影响，不同分子量的物质从胞内释放速率略有差异。整体而言，发酵初期随着发酵体系中乳杆菌数量的增加，贝母和雪梨细胞壁破碎程度增加，大量的多酚、黄酮被释放到发酵液中；但随着发酵时间的延长，底物不断消耗，部分多酚、黄酮可能被乳杆菌消耗以满足自身生长需要，导致发酵贝母-雪梨汁中多酚、黄酮的含量产生下降趋势。

2.3.2 植物乳杆菌发酵贝母-雪梨汁最佳工艺研究

对影响贝母-雪梨汁乳杆菌复合发酵的贝母添加量（A）、发酵时间（B）、乳杆菌接种量（C）和蔗糖添加量（D）4个因素进行三水平正交试验优化，以贝母-雪梨汁发酵体系中的多酚和黄酮含量为评价指标进行加权综合评定，试验结果如表2、表3所示。

表2 正交试验表Table 2 Orthogonal test table

续表2 正交试验表Continue table 2 Orthogonal test table

由表2的结果可知：以多酚含量为评价指标时，4个因素对发酵贝母-雪梨汁的影响依次为：发酵时间（B）>贝母添加量（A）>乳杆菌接种量（C）>蔗糖添加量（D），多酚含量最高的工艺参数组合为：A2B2C1D3，即贝母添加量为0.3 g/L，发酵时间为41 h，乳杆菌接种量为3%，蔗糖添加量为1.5 g/L。以黄酮含量为评价指标时，各因素对发酵贝母-雪梨汁的影响依次为：蔗糖添加量（D）>发酵时间（B）>乳杆菌接种量（C）>贝母添加量（A），黄酮含量最高的工艺参数组合为：A2B2C2D3，即贝母添加量为0.3 g/L，发酵时间为41 h，乳杆菌接种量为5%，蔗糖添加量为1.5 g/L。多酚和黄酮含量最高值对应的最优工艺参数组合分别为：A2B2C1D3和A2B2C2D3，二者差异在于C工艺参数的不同。由表3正交试验方差分析可知，因素C对发酵贝母-雪梨汁多酚、黄酮含量的影响为不显著因素。以C为变量，进行验证试验，结果发现多酚、黄酮含量最高的工艺组合为A2B2C2D3，即贝母添加量为0.3 g/L，发酵时间为41 h，乳杆菌接种量为5%，蔗糖添加量为1.5 g/L，测得多酚含量为298.75 mg/L，黄酮含量为961.27 mg/L。

由表3正交试验方差分析可知：贝母添加量（A）对于贝母-雪梨汁发酵液中多酚和黄酮的含量均有显著影响；发酵时间（B）对贝母-雪梨汁发酵液中多酚含量影响显著；蔗糖添加量（D）对发酵液中黄酮含量影响显著。乳杆菌接种量（C）对多酚、黄酮含量的影响不显著。

表3 正交试验方差分析表Table 3 Orthogonal test analysis of variance

2.4 植物乳杆菌发酵贝母-雪梨汁工艺优化前后抗氧化能力测定

比较不同稀释浓度（0.1、0.125、0.2、0.5、1）下发酵贝母-雪梨汁优化前后抗氧化能力的变化见图7。

图7 植物乳杆菌发酵贝母-雪梨汁工艺优化前后抗氧化能力测定Fig.7 Determination of antioxidant capacity of Lactobacillus plantarum fermented fritillaria-pear juice before and after optimization

由图7可知，优化后的植物乳杆菌发酵贝母-雪梨汁抗氧化能力较优化前有明显提高，样品浓度越高时，抗氧化效果差距越明显（p<0.05），与之前测定的发酵液中多酚和黄酮类物质含量结果一致。结果表明，发酵贝母-雪梨汁新型功能性饮料的抗氧化性能与多酚、黄酮的含量呈正相关，即多酚、黄酮含量越高，抗氧化效果越明显。

3 结论

该研究通过植物乳杆菌发酵的方式，对贝母-雪梨汁的抗氧化功能进行强化，以生产出具有保健功能的贝母-雪梨汁饮品。结果发现，乳杆菌发酵可显著增加贝母-雪梨汁中多酚和黄酮的含量，与未发酵组相比二者含量分别提高了33.03%和27.60%，且表现出更好的抗氧化效果。

以多酚和黄酮含量为指标，通过正交试验优化获得植物乳杆菌发酵贝母-雪梨汁的最佳工艺条件：植物乳杆菌接种量5%，蔗糖添加量1.5 g/L，发酵时间41 h，贝母添加量0.3 g/L，最终发酵贝母-雪梨汁中多酚含量为298.75 mg/L，黄酮含量为961.27 mg/L。发酵贝母-雪梨汁口感良好，具有良好的抗氧化功能，是理想的新型保健饮品，具有一定的发展前景。