南极磷虾多肽的组成及其抗氧化与A C E抑制活性

刘小芳，颜征，冷凯良，2，*，孙如男，3，于源，苗钧魁

（1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业农村部极地渔业开发重点实验室，山东青岛266071；2.青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋药物与生物制品功能实验室，山东青岛266200；3.青岛大学药学院，山东青岛266021）

南极磷虾（Euphausia superba）又名大磷虾或南极大磷虾，是一种生活在南极海域的小型甲壳类浮游动物[1]。南极磷虾资源蕴藏量巨大，生物量达到6.5亿吨～10亿吨，具有成为我国第二个远洋渔业的巨大潜力[2-3]。南极磷虾中蛋白质含量丰富，约达到11.9%～16.3%（鲜基），且富含人体所需的多种必需氨基酸，是极具开发价值的海洋优质蛋白质资源[1，4]，但目前尚未得到充分利用。研究明确南极磷虾蛋白的生物活性，精准定位应用领域，是提高南极磷虾蛋白资源利用率和促进南极磷虾产业发展的关键。

近年来，已有许多文献报道多肽具有良好的生物活性，如抑菌、抗氧化、抗疲劳、抗衰老、改善骨质疏松、抗肿瘤、调节免疫和保护心血管等[2，4，5-9]。因此，富含活性多肽的产品受到消费者的广泛喜爱，多肽被应用于食品、药品、保健品和化妆品等领域，具有良好的市场前景。常用的多肽提取方法有溶剂提取法、酶解提取法、超声辅助提取法[10]，但存在多肽得率低、耗时长的缺点。近年来，为克服这些缺点，国内外学者开发了超声辅助酶解、亚临界水提取、双酶法酶解等方法[11-14]，具有水解效果佳、肽得率高和活性好的优点。本文采用碱溶酸沉法与酶解法联用的技术制备南极磷虾多肽，初步分析多肽的组成及结构，重点评价其体外抗氧化和降血压活性，以期为南极磷虾蛋白资源的高效利用提供理论依据，为南极磷虾多肽在相关领域的精准应用提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南极磷虾冻虾：由中国水产科学研究院黄海水产研究所“南极海洋生物资源开发与利用”项目组提供，打浆，搅拌均匀，保存于-80℃待用。

Lowry蛋白浓度测定试剂盒、ABTS、透析袋：北京索莱宝科技有限公司；血管紧张素I转化酶（angiotensin-I converting enzyme，ACE，≥10 U/mg）、N-[3-（2-呋喃基）丙烯酰基]-L-苯丙酰胺-甘氨酸-甘氨酸{N-[3-（2-Furyl）acryloyl]-Phe-Gly-Gly，FAPGG}：Sigma-Aldrich公司；4-羟乙基哌嗪乙硫磺酸 [4-（2-hydroxyerhyl）piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES]、氢氧化钠、盐酸、三氯乙酸（分析级）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ST3100型pH计：奥斯豪（常州）仪器有限公司；UV1102Ⅱ型紫外/可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；CTFD-10P型冷冻干燥机：青岛永合创信电子科技有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅、SHA-B型恒温振荡器：常州智博瑞仪器制造有限公司；BAS224S-CW型电子天平：赛多利斯（北京）科学仪器有限公司；Neofuge 15R型高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 南极磷虾蛋白的提取

采用碱溶酸沉法[15]（两次碱溶、两步酸沉）分离蛋白：称取一定量的南极磷虾虾浆，加入蒸馏水[水料比6 ∶1（mL/g）]，搅拌均匀，调节 pH 值至 11.5，4 ℃搅拌浸提 30 min，离心（5 000 r/min，10 min）得到上层液体A和沉淀A。将沉淀A进行二次碱溶，水料比为3 ∶1（mL/g），调节 pH 值至 11.5，4 ℃搅拌浸提 30 min，离心（5 000 r/min，10 min）得到上层液体B和沉淀B。将液体A和液体B混合得到液体C，将液体C的pH值调至 5.5，静置 20 min，离心（5 000 r/min，10 min）得到沉淀D和上层液体D，将液体D的pH值调至4.6，静置 20 min，离心（5 000 r/min，10 min）得到沉淀 E，合并沉淀D和沉淀E，透析脱除盐和单糖等物质，冷冻干燥即得南极磷虾蛋白。

1.3.2 南极磷虾多肽的制备

采用碱性蛋白酶酶解制备多肽[13]：称取一定质量的南极磷虾蛋白（1.3.1）分散于蒸馏水中[水料比25∶1（mL/g）]，搅拌均匀，调节pH值至9.0，50℃水浴15 min（预热），加入碱性蛋白酶（6 000 U/g）酶解1 h（酶解温度50℃，水浴振荡速度150 r/min），100℃灭酶15 min，冷却至室温（25℃），将 pH 值调至 4.0，离心（5 000 r/min，30 min）收集上清液，调节pH值至7.0，抽滤后经正己烷对酶解液脱脂，冷冻干燥即得南极磷虾多肽。

1.3.3 总蛋白质含量的测定

按照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法的规定执行。

1.3.4 水解度的测定

水解度为酶解液中氨基酸态氮含量与总氮含量的比值。氨基酸态氮含量的测定按照GB 5009.235-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》中酸度计法的规定执行。总氮含量的测定按照GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法的规定执行。

1.3.5 多肽得率的测定

参照文献[16]的方法进行测定：将酶解液（稀释数倍）与等体积的10%的三氯乙酸混合，30℃水浴30min，然后5 000 r/min离心10 min，除去大分子蛋白质。采用Lowry法测定多肽浓度，多肽得率按下式计算：

1.3.6 多肽的紫外-可见光谱（ultraviolet-visible spectroscopy，UV-Vis）检测

称取5mg多肽粉末（1.3.2）溶于10mL蒸馏水，采用紫外-可见分光光度计在230 nm～400 nm进行扫描[14]。

1.3.7 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometry，FT-IR）检测

采用傅里叶变换红外分光光度计进行扫描，记录500 cm-1至4 000 cm-1范围内样品的FT-IR光谱[14]。

1.3.8 多肽分子量测定

按照GB 31645-2018《食品安全国家标准胶原蛋白肽》中附录A规定的方法执行。

1.3.9 多肽氨基酸组成分析

按照GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》的规定执行。

1.3.10 多肽的还原力测定

参照文献[17]的方法进行测定：1.5 mL多肽样品溶液中加入1.5 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH6.6）和1.5 mL铁氰化钾溶液（1%质量分数），混匀，50℃水浴20 min，加入0.75 mL三氯乙酸溶液（10%质量分数），4 000 r/min离心10 min。取1.5 mL上层清液与0.3 mL三氯化铁溶液（0.1%质量分数），1.5 mL蒸馏水混匀，室温（25℃）静置10 min，在700 nm波长下测吸光值，吸光值越大还原能力越强。

1.3.11 清除DPPH自由基能力测定

参照文献[13-14]的方法进行测定：2 mL多肽样品溶液中加入2mLDPPH乙醇溶液（0.2mmol/L），混匀，室温（25℃）避光静置30min，离心（3500r/min，10min），在517 nm波长下测定吸光值。DPPH·清除率的计算公式为：

式中：A0为对照组吸光值；Ai为样品组吸光值；Aj为空白组吸光值。

1.3.12 清除ABTS+自由基能力测定

参照文献[18]的方法进行测定：将0.4 mL的样品溶液与3.6 mL ABTS溶液混合，室温（25℃）下避光反应5 min，在734 nm波长下测定吸光值。ABTS+自由基清除率的计算公式为：

式中：B0为对照组吸光值；Bi为样品组吸光值；Bj为空白组吸光值。

1.3.13 清除羟自由基能力测定

参照文献[17]的方法进行测定：在1 mL多肽样品溶液中依次加入0.5 mL硫酸亚铁（9 mmol/L），1 mL的水杨酸乙醇溶液（9 mmol/L），1 mL双氧水（4.4 mmol/L）和2 mL蒸馏水，37℃水浴1 h，4 000 r/min离心15 min，在510 nm波长下测定吸光值。·OH清除率的计算公式如下：

式中：C0为对照组吸光值；Ci为样品组吸光值；Cj为不加双氧水的样品吸光值。

1.3.14 ACE抑制活性

参照文献[19-20]的方法进行测定。按表1所示，依次添加各反应组分，在37℃下温育30 min，在340 nm波长下分别测定各孔在0、30 min的吸光值。

表1 南极磷虾多肽的ACE抑制活性测定Table 1 ACE inhibitory activity of the Antarctic krill polypeptides

ACE抑制率的计算公式如下：

式中：A为对照孔吸光值的减少值；B为样品孔吸光值的减少值。

2 结果与分析

2.1 水解度和肽得率

采用碱溶酸沉法和酶解法联用制备南极磷虾多肽，具有较好的水解度和多肽得率，分别达到（17.83±3.73）%和（57.20±0.24）%。刘璐等[21]采用单因素和正交试验优化了碱性蛋白酶酶解制备南极磷虾多肽的工艺，在最佳条件下，水解度略高于本研究，但酶解时间是本研究的5倍。张元元等[22]采用单因素和响应面试验优化南极磷虾多肽的酶解制备工艺，水解度为12.88%，低于本研究结果。

2.2 紫外-可见吸收光谱

南极磷虾多肽的紫外-可见吸收光谱如图1所示，南极磷虾多肽的特征吸收波长范围在270 nm～280 nm，最大特征吸收波长为273.5 nm。

图1 南极磷虾多肽的紫外-可见吸收光谱Fig.1 UV-Vis spectra of the Antarctic krill polypeptides

2.3 FT-IR光谱

南极磷虾多肽的傅里叶变换红外光谱如图2所示。

图2 南极磷虾多肽的FT-IR光谱Fig.2 FT-IR spectra of the Antarctic krill polypeptides

南极磷虾多肽具有多肽的特征吸收峰[23]，在3 390.84 cm-1处有N-H伸缩振动的强吸收峰（酰胺A带），在2 917.66 cm-1处有C-N伸缩振动的特征吸收峰（酰胺B带）[23-24]，在 1 648.36 cm-1有C＝O伸缩振动所引起的特征吸收峰（酰胺I带），1 547.59 cm-1处的特征吸收峰归属于酰胺II带，在1 402.21 cm-1处有C＝O伸缩振动和N-H弯曲振动所引起的吸收峰（酰胺III带）[14，25-27]。

2.4 多肽的分子量分布

南极磷虾多肽的分子量分布如图3所示。

图3 南极磷虾多肽的分子量分布Fig.3 Molecular weight distribution of the Antarctic krill polypeptides

南极磷虾多肽的分子量主要在189 Da～6500 Da，符合生物活性肽分子量分布范围[28]，其中，451 Da～1 450 Da占比最高（41.00±0.05）%。刘云姣等[29]使用胰蛋白酶酶解制备南极磷虾多肽，采用凝胶电泳分析发现多肽分子量主要集中分布在5 kDa以下，与本研究结果相似。

2.5 多肽的氨基酸组成分析

南极磷虾多肽的氨基酸组成与含量如表2所示。

南极磷虾多肽共检出17种氨基酸，含有7种必需氨基酸，其中，谷氨酸含量最高，占总氨基酸含量的14.00%，天冬氨酸含量次之，占总氨基酸含量的11.76%。必需氨基酸占比为40.32%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为67.56%，均符合联合国粮农组织/世界卫生组织规定的标准（必需氨基酸占氨基酸总量的40%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为60%），说明南极磷虾多肽营养价值良好，符合理想模式[30-31]。

表2 南极磷虾多肽的氨基酸组成与含量Table 2 Amino acid compositions of the Antarctic krill polypeptides

2.6 多肽的还原能力

南极磷虾多肽的还原能力如图4所示。

图4 南极磷虾多肽的还原能力Fig.4 Reducing power of the Antarctic krill polypeptides

南极磷虾多肽具有显著的还原能力。随着多肽浓度增大，吸光值增大，说明还原能力越来越强，与史亚萍等[32]的研究具有相同的趋势。Ambigaipalan等[33]从虾壳加工废弃物中制备多肽，也具有显著的还原能力。

2.7 多肽清除DPPH自由基能力

南极磷虾多肽清除DPPH·的能力如图5所示。

图5 南极磷虾多肽的DPPH·清除活性Fig.5 DPPH·scavenging ability of the Antarctic krill polypeptides

南极磷虾多肽浓度为1 mg/mL～8 mg/mL时，DPPH·清除率为（16.87±3.81）% ～（60.73±1.50）%。随着多肽浓度的升高，清除能力增强，与张元元等[22]的研究结果一致，但本研究所制备的南极磷虾多肽的清除DPPH·的能力更强。经计算，南极磷虾多肽清除DPPH·的 IC50值为 5.65 mg/mL。

2.8 多肽清除ABTS+自由基

南极磷虾多肽清除ABTS+自由基的能力如图6所示。

图6 南极磷虾多肽的ABTS+自由基清除活性Fig.6 ABTS+scavenging ability of the Antarctic krill polypeptides

南极磷虾多肽以浓度依赖的方式清除ABTS+自由基，清除能力显著。当多肽浓度为2 mg/mL时，ABTS+自由基清除率达到（93.81±0.10）%。经计算，南极磷虾多肽清除ABTS+自由基的IC50值为0.17 mg/mL。与牛脊髓肽[18]、乌贼墨多肽[34]和猪脑水解肽[35]相比，南极磷虾多肽具有较强的清除ABTS+自由基能力，说明南极磷虾是多肽类抗氧化剂的良好来源。

2.9 多肽清除羟自由基

南极磷虾多肽清除·OH的能力如图7所示。

随着南极磷虾多肽浓度的增加，·OH清除率逐渐提高，当多肽浓度为10 mg/mL时，·OH清除率达到（96.22±3.50）%。经计算，南极磷虾多肽清除·OH的IC50值为4.46 mg/mL。

图7 南极磷虾多肽的·OH清除活性Fig.7·OH scavenging ability of the Antarctic krill polypeptides

2.10 多肽的ACE抑制活性

南极磷虾多肽的ACE抑制活性见图8。

图8 南极磷虾多肽的ACE抑制活性Fig.8 ACE inhibitory activity of the Antarctic krill polypeptides

南极磷虾多肽具有显著且良好的抑制ACE的能力，随着多肽浓度增大，多肽抑制ACE的能力增强。当多肽浓度为0.5 mg/mL时，ACE抑制率为（55.91±2.63）%。高颖等[36]通过研究发现低氟南极磷虾肽也具有良好的抑制ACE活性；Zhao等[7]采用超滤法和色谱法从南极磷虾蛋白水解物中分离出8种降血压肽，特别是Trp-Phe和Phe-Ala-Ser对ACE表现出明显的抑制活性；以上研究结果说明南极磷虾是多肽类降血压剂的良好来源。

3 结论

本文采用碱溶酸沉（两步碱溶、两步酸沉）与碱性蛋白酶酶解联用法制备南极磷虾多肽，具有较好的水解效果和较高的肽得率，所得多肽的分子量≤6 500 Da（98.93%），氨基酸组成理想，且多肽呈现良好的抗氧化活性和ACE抑制活性，南极磷虾是制备多肽类抗氧化剂和降血压剂的良好原料。未来研究可对获得的南极磷虾多肽进一步分离纯化，筛选得到活性最优组分，并解析其构效关系，开发出具有特定功效的活性肽产品。本研究可为南极磷虾多肽在相关领域的精准应用提供科学指导，推动南极磷虾资源的高效高质利用。