XDA-4型大孔树脂对黄芪总皂苷富集工艺的优选

刘瑞，张弘弛，*，延文星，周凤，李慧

（1.大同大学生命科学学院，山西大同037009；2.大同大学应用生物技术研究所，山西大同037009）

在20世纪70年代，国外在医药行业、污水处理行业就广泛地使用了大孔吸附树脂用以除去污水中的有害物质，分离天然药物中的有效成分。其吸附分离过程综合了机械筛分和化学吸附原理，具有吸附性独特、选择性高、不受无机物影响、使用周期长、节省费用等优点，广泛应用于皂苷类物质的提取[1-2]。有关大孔树脂对中药中皂苷类和黄酮类成分纯化的报道已有不少，但对黄芪中总皂苷类成分的相关报道相对较少[3-4]。

在我国的内蒙包头、山西浑源、甘肃陇西、山东莱阳等地均有黄芪生长。其中以山西浑源、甘肃陇西的黄芪最为有名，且药用价值最高。黄芪皂苷是黄芪中的重要生理活性物质，但不同年份、不同产地、不同品种的黄芪中皂苷含量均不相同，导致市面上的黄芪质量参差不齐，很难形成产业化、规模化发展[5]。如今，中药制剂化发展迅速，把传统中药中的生理活性物质提纯后作为药品更有利于药剂师和医生的精确用药，从而更加有利于传统中药的现代化。市面上高纯度的黄芪皂苷每克售价均在200元～300元，黄芪中总皂苷的含量为7.5 mg/g～17.2 mg/g，因此提纯黄芪中的各种皂苷活性物质具有巨大的经济效益。一般采用的提取黄芪总皂苷的方法为回流提取法，这种方法存在提取速度慢、黄芪总皂苷含量不高、分离成本较高等缺点。而大孔树脂法分离黄芪总皂苷可有效降低成本，提高提取速度和黄芪总皂苷的含量，因此对黄芪总皂苷的大孔树脂分离纯化和富集的方法进行了系统研究和工艺优化。

1 材料和仪器

黄芪根（粉碎后试验）：山西浑源万生黄芪开发有限公司；黄芪甲苷对照品（编号Z0371312）：北京谱析科技有限公司；XSA-5B、XDA-1、XSA-5、XSA-40、XDA-4、LSA-10、D101 树脂、无水乙醇、乙酸、香草醛、高氯酸：国药集团化学试剂有限公司；试剂均为分析纯。

XFB-200型小型中药粉碎机：吉首中诚制药厂；HH-3三孔三控温水槽、T650CT双头恒温超声波提取机：上海左乐仪器有限公司；SHB-IIIA型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；RE-2000E型旋转蒸发器：西安禾普生物科技有限公司；UV-3200S紫外分光光度计：上海美国谱达仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 黄芪总皂苷的测定

2.1.1 黄芪总皂苷的提取及检测方法

在微量天平（千分之一）上称取20 g黄芪粉末，按照1∶20（g/mL）加入浓度75%的乙醇溶液，将提取液置于超声波破碎仪中（功率设置200 W），超声助溶后，放入25℃的恒温摇床120 r/min增加其溶解效果（振荡12 h），将提取液在定性滤纸上进行抽滤，将滤液转移至锥形瓶备用。参照文献[6]的香草醛－高氯酸比色法测定黄芪总皂苷含量。

2.1.2 最佳吸收波长的选择及黄芪甲苷标准曲线的绘制

用超微量天平称取3 mg黄芪甲苷标准品，转移至10 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，按照上述方法进行显色反应。以相应的空白对照分别在紫外可见分光光度计上进行全波长扫描，测出显色反应之后的最大吸收波长。用移液枪量取 0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL黄芪甲苷样品液置于试管中，再加入95%的乙醇定容至1 mL，显色。其中，1号试管中的溶液为空白对照。

2.2 静态吸附和脱附试验

2.2.1 不同树脂吸附解吸筛选试验

准确称取XSA-5B、XDA-1、XSA-5、XSA-40、XDA-4、LSA-10、D101树脂0.5 g，分别置于150 mL三角瓶中依次标号1～7，在每个三角瓶中准确加入黄芪提取液50 mL，将其转移至恒温摇床中振荡吸附12 h（120 r/min、25℃），将吸附后液体用于测定黄芪总皂苷含量，按如下公式计算吸附量。将饱和吸附后的各型号树脂用去离子水清洗3遍分别置于50 mL烧杯中，用移液管准确量取95%乙醇50 mL放入烧杯，解吸12 h，测出黄芪总皂苷含量，按如下公式计算解吸量和解吸率。

式中：Qe为干树脂的吸附量，mg/g；Qd为干树脂的解吸量，mg/g；D为解吸率，%；C0为黄酮提取液的初始浓度，mg/mL；Vi为黄酮样品液的初始体积，mL；Ce为吸附平衡后的每毫升溶液中黄酮的浓度，mg/mL；Cd为解吸液的浓度，mg/mL；Vd为解吸液的体积，mL；W为树脂的干重，g。

2.2.2 在所选树脂上的吸附动力学平衡的建立

将50 mL样品溶液加入到150 mL的三角瓶中，加入提前称重的所选大孔树脂（等于0.5 g干树脂）。三角瓶在摇床上以25℃，120 r/min振荡。每隔30 min测试吸附液中黄芪总皂苷的浓度，直到达到吸附平衡，得到吸附动力学曲线。

通过伪一阶和伪二阶模型的适用性，预测了吸附过程中所涉及的机理。伪一阶和伪二阶模型可由以下数学公式表示：

式中：Qe为达到吸附平衡时每克吸附剂中溶质的浓度，也就是吸附能力，mg/g；Qt为t时刻每克吸附剂中溶质的浓度，mg/g；k1和k2分别是伪一阶和伪二阶速率常数。设定初始条件为t＝0，Qt＝0时，两个动力力学方程具有解吸解。如下：

2.2.3 提取液pH值影响黄芪总皂苷吸附量的试验

准确称取5组0.5 g树脂置于150 mL三角瓶中，依次标号1～5，按照不同的pH值将黄芪总皂苷提取液加入到 1～5号锥形瓶中，pH值分别为 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将其转移至恒温摇床中振荡吸附12 h（120 r/min、25℃），将吸附后液体，测出黄芪总皂苷含量。

2.2.4 黄芪总皂苷吸附模型（吸附等温线）的测定

在千分之一天平上准确称取0.5 g干树脂15组，转移至三角瓶中依次标号1～15，每3组加入相同初始浓度的黄芪提取液50 mL，将加入不同浓度样液的三角瓶同批放入恒温摇床中振荡吸附12 h（120 r/min），温度分别设置为20、25、30℃，测出黄芪总皂苷含量。

2.2.5 吸附时间影响黄芪总皂苷吸附量的试验

在千分之一天平上准确称取0.5 g干树脂，加入50 mL黄芪提取液置于恒温摇床中振荡吸附（25℃，120 r/min），每隔30 min取样0.5 mL，测出黄芪总皂苷含量。

2.3 动态吸附和脱附试验

采用预处理后的水合树脂（3 g干树脂）进行动态吸附和解吸试验。

2.3.1 装载量的优化（动态泄露曲线的测定）

用预处理的所选树脂在湿式玻璃柱上装柱，将黄芪提取液加于柱顶，研究最大装载量。控制流速为1.0 BV/h，分段收集流出液，每份5 mL，测定流出的液体中黄芪总皂苷的浓度，得到动态泄露曲线。

2.3.2 洗脱液浓度的优化

用预处理所选树脂在湿式玻璃柱上装柱，用之前制备黄芪提取液逐滴上样，用30%～90%浓度的乙醇进行梯度洗脱。测定流出的液体中黄芪总皂苷的浓度，选出最佳的洗脱液浓度。

2.3.3 洗脱液流速的优化

用预处理所选树脂在湿式玻璃柱上装柱，用黄芪提取液上样，取1 BV洗脱液，分别控制洗脱液流速为1.0、1.5、3.0 BV/h，测定洗脱液中黄芪总皂苷的浓度，计算解吸量。

3 结果与分析

3.1 测定最大吸收波长及标准曲线的结果

提取液显色后进行全波长扫描，测出的最大吸收波长为585 nm。横轴为黄芪甲苷标准样品溶液的浓度值，纵轴为试验测定的吸光度值，用origin 8.0制作标准曲线，获得的标准曲线方程为y＝0.044 2x+0.013 6（r＝0.996），式中：y为吸光度值；x为黄芪总皂苷浓度，μg/mL。此方程具有良好的线性关系。

3.2 静态吸附和脱附试验结果

3.2.1 各型号树脂的黄芪总皂苷吸附解吸结果

不同大孔树脂对黄芪总皂苷的吸附能力、解吸能力和解吸率见图1。

图1 不同大孔树脂对黄芪总皂苷的吸附能力、解吸能力和解吸率Fig.1 Adsorption capacity，dissociation capacity and dissociation rate of different macroporous resins for astragalus saponins

选择大孔树脂时要求树脂对目标皂苷吸附容量大、选择性高、吸附速率快、解吸容易并且再生容易。吸附容量和吸附速率可采用静态吸附法确定各型号树脂吸附和解吸黄芪总皂苷的含量及解吸率[7]。如图1所示，从吸附效果和解吸效果来看，XDA-4树脂都明显好于其它树脂，故选用XDA-4型树脂进行后续试验。

3.2.2 黄芪总皂苷在XDA-4树脂的吸附动力学

黄芪总皂苷在XDA-4树脂上的吸附动力学曲线，拟一阶动力学模型和拟二阶动力学模型的相关线形图见图2。

图2 黄芪总皂苷在XDA-4树脂上的吸附动力学曲线，拟一阶动力学模型和拟二阶动力学模型的相关线形图Fig.2 The adsorption kinetics curve of astragalus saponins on XDA-4 resin and the correlation line graph of the pseudo-firstorder kinetics model and the pseudo-second-order kinetics model

接触时间是决定吸附行为的另一个重要因素。为了评价接触时间对吸附性能的影响，得到了黄芪总皂苷在XDA-4树脂上的吸附动力学曲线（图2a）。大孔树脂对皂苷类成分吸附速率的快慢可以通过静态吸附试验测定。黄芪总皂苷在XDA-4树脂上的吸附量在初始的240 min随吸附时间的延长而迅速增长，在250 min后达到动态平衡。因此在后续试验中采用240 min的吸附时间较为合适。

参照文献中试验常采用假一级动力学方程或假二级动力学方程进行拟合[8]。大孔树脂的动态吸附过程可以采用General rate model（GR模型）[9]。该模型考虑了各种影响色谱传质的因素，具有普适性，但是形式较为复杂。因未有色谱精制皂苷类成分的数学建模研究，本研究比较了Guiochon等综述的多种GR模型的简化形式[10]，最终选择了“lg（Qe-Qt）与t”和“t/Qt与t”的关系曲线。“lg（Qe-Qt）与t”和“t/Qt与t”的关系曲线如图2b和2c所示，从这些曲线的斜率计算出k1和k2的值，用拟二阶动力学模型解释了黄芪总皂苷在XDA-4树脂的吸附情况，得出黄芪总皂苷在XDA-4树脂上的吸附动力模型如下：

拟一阶动力学方程：

t/Qe=7.046 83t+0.687 1，R2=0.882 89

拟二阶动力学方程：

lg（Qe-Qt）=-0.0418t+1.090 93，R2=0.984 2

3.2.3 提取液pH值对吸附量的影响

上样时样品的pH值是决定吸附行为的一个重要因素，为了解上样时pH值对吸附性能的影响，得到了黄芪总皂苷在XDA-4树脂上的吸附量随pH值的变化，见图3。

图3 XDA-4树脂在不同pH值条件下对黄芪总皂苷的吸附能力Fig.3 Adsorption capacity of XDA-4 resin on astragalus saponins at different pH values

如图3所示，pH值从5.0上升至7.0的过程中吸附量明显上升，但随着pH值的继续上升吸附量却急剧下降，因此选择接近中性的样液进行上样比较合适。黄芪提取液的初始pH值为7.06，因此，在上样过程中无需调整pH值。

3.2.4 黄芪总皂苷在XDA-4上的吸附模型（吸附等温线）的建立

对于不同树脂和药液使用Langmuir方程或Freundlich方程拟合结果的优劣可能不同[9]。为了选出最佳的上样条件，建立了Langmuir等温线和Freundlich等温线，见表1。吸附等温线见图4。

表1 不同温度下黄芪总皂苷在XDA-4大孔树脂上的Langmuir方程和Freundlich方程Table 1 Langmuir isotherm and Freundlich isotherm of the adsorption capacity curve of astragalus saponins on XDA-4 resin at different temperture

经过建立吸附模型，如图4所示，发现在20℃下，上样浓度为0.72 mg/mL吸附效果最好。

3.3 动态吸附和脱附试验结果

3.3.1 装载量的优化结果

黄芪总皂苷在XDA-4树脂上的动态泄露曲线见图5。

图4 黄芪总皂苷在20、25、30℃XDA-4树脂上的吸附等温线Fig.4 Adsorption isotherms for total astragalus saponins on XDA-4 resin at 20，25，30℃

图5 黄芪总皂苷在XDA-4树脂上的动态泄露曲线Fig.5 Dynamic leakage curve of astragalus saponins on XDA-4 resin

如图5所示，随着黄芪提取液装柱体积的增加，流出液中的黄芪总皂苷的浓度也在不断的增加，吸附率会逐渐降低，当流出液收集到80 mL的时候洗脱液中黄芪总皂苷的浓度迅速增加，表明此时已经达到泄漏点。因此，选择上样体积为80 mL。

3.3.2 洗脱液浓度的优化结果

洗脱液浓度初步优化结果见图6。

图6 不同浓度乙醇溶液对XDA-4树脂洗脱能力的影响Fig.6 Effect of different ratio of ethanol solution on elution capacity on XDA-4 resin

图6表明，当乙醇浓度小于40%，对黄芪总皂苷的洗脱能力很弱，乙醇浓度在40%～80%之间，对黄芪总皂苷的洗脱能力随着乙醇浓度的升高而提升，当乙醇浓度达到80%时，黄芪总皂苷在乙醇洗脱液中的浓度明显提高，且在优化过程中发现，分不同浓度乙醇洗脱，可以在皂苷损失很少的情况下除去更多杂质，而乙醇比例达到80%之前，洗脱能力明显提高，80%之后洗脱能力变化不大，选择80%乙醇为最佳洗脱剂。所以，在后续的常规优化过程中先选用40%～60%乙醇洗脱除去杂质，再使用80%乙醇洗脱，富集高浓度黄芪总皂苷。这一结果与杜海胜等[11]用HPD400-A树脂纯化胡芦巴总皂苷类似，水洗涤之后采用低体积分数乙醇（30%）进行第2次洗涤，在皂苷损失很少的情况下除去更多杂质。

3.3.3 洗脱流速优化结果

累积解吸率随解吸液体积变化曲线和累积解吸率随时间变化曲线见图7。

图7 累积解吸率随解吸液体积变化曲线和累积解吸率随时间变化曲线Fig.7 Curve of cumulative dissociation rate with dissociated liquid product and curve of cumulative dissociation rate with time

为了有效地从树脂中解吸出黄芪总皂苷，一个合适的流速十分必要，Yamamoto等[12]线性增加的解吸剂能增加不同成分的分离度。解吸流速的选择需要综合考虑解吸剂消耗和时间消耗，Fu等[13]研究结果表明，较低的解吸流速可以减少解吸剂用量，但消耗的时间明显增加。从图7可以看出，当洗脱剂流速在1 BV/h和1.5 BV/h时，洗脱液中黄芪总皂苷的浓度较高。随着流速增快，解吸率明显下降，因此选择洗脱流速为1.5 BV/h较为合适。

4 结论和讨论

本试验前期进行了静态吸附试验和静态解吸试验，优选了树脂型号、吸附温度、吸附时间、上样pH值等参数，进一步进行吸附/脱附试验，优化洗脱液浓度、脱附流量。XDA-4型大孔吸附树脂对黄芪中黄芪总皂苷吸附和分离性能最强，通过吸附动力学分析和吸附模型的建立，得出其最佳工艺为：黄芪提取液中的黄芪总皂苷的浓度控制在0.72 mg/mL，无需额外调节其pH值，上样体积为80 mL，吸附时间不少于240 min，80%乙醇以1.5 BV/h的速度进行洗脱。

Wan等[14]用 DS-401树脂精制三七皂苷，先用30%乙醇解吸人参三醇型皂苷，再用80%乙醇解吸人参二醇型皂苷，实现了两大类皂苷的分离。本研究中未涉及分步实现多种黄芪皂苷的同步分离，在本研究基础上，后续将继续精细大孔树脂的分离工艺，期望实现同步分批多类型黄芪皂苷的分离。

在试验过程中发现在保持树脂干重相同的情况下，装柱后测得的装床体积每次都有不同程度的变化。查阅资料后发现活化大孔树脂时乙醇的浓度、活化时的温度、活化时间都对大孔树脂的膨胀率有明显影响。因此，在之后的活化过程中将乙醇浓度固定在80%，置于20℃的恒温摇床中活化4 h，之后的柱床体积基本保持不变。在动态吸附的研究过程中，上样完成后用6倍柱床体积的去离子水洗去未吸附的提取液后，发现大孔树脂出现漂浮的情况并且柱床中出现了零零散散的气泡。考虑到经过乙醇活化后的大孔树脂密度明显低于水的密度才会出现这种情况，因此在之后的清洗过程中先逐滴加入去离子水，待不再出现大孔树脂大量漂浮的情况后再大量加入去离子水。而柱床中出现气泡的情况可能是由于去离子水流速过快导致，在之后的清洗过程中降低去离子水的流速，并用吸耳球不断敲击层析柱使气泡分离出去，之后便不再出现这种情况。在试验中为节约大孔树脂，所使用过的树脂都应该进行再生[15]后重复利用。

黄芪总皂苷含量较低，各产地药材间差别较大[16]，质量控制较为困难，经过大孔树脂分离方法优化可有效解决以上问题。大孔树脂层析法处理后黄芪总皂苷浓度明显提高，该方法有无毒、成本低、高效、操作简单等优点。