放射性核素标记耐久霉素细胞凋亡显像的研究进展

黄旭虎，李洪玉

(原子高科股份有限公司，北京 102413)

细胞死亡是人体重要的生理或病理现象,根据死亡细胞生化和分子水平的差异，主要分为程序性细胞死亡(如凋亡)和非程序性细胞死亡(如坏死)。细胞凋亡广泛存在于人体的各个系统，其失调与很多疾病的发生和发展有关。当细胞凋亡不足时，就会导致肿瘤的发生,而细胞凋亡过度时，则会产生获得性免疫缺陷综合征、神经退行性疾病及移植排斥反应等。因此检测凋亡对认识疾病、评价和指导疾病的治疗以及开发相关药物等具有重要意义。

传统的凋亡检测方法均为体外检测，主要包括光学显微镜观察、原位末端标记法分析、流式细胞仪检测等，但这些方法都需要活体取材，属于有创性的检测方式，并且通常只能在某一时间点观察凋亡，无法动态连续监测凋亡在体内的发生与发展过程。随着分子影像学技术的不断发展，各种凋亡分子影像学技术的研究日渐成熟，为活体内动态监测细胞凋亡提供了全新的无创研究手段。放射性细胞凋亡显像[1-4]是研究较为深入的体内细胞凋亡检测技术，通过放射性核素标记化合物与细胞凋亡过程中产生的特有靶点结合，采用影像学手段检测细胞凋亡部分浓聚的探针分子，从而显示凋亡。

细胞凋亡显像在肿瘤研究中具有重要意义，放射性核素标记耐久霉素在肿瘤影像学和疗效评价方面都表现出潜在的临床应用价值，本文综述了近年来放射性核素标记耐久霉素在制备和纯化方法、生物分布、疗效评价等方面的研究进展，并对放射性核素标记耐久霉素的临床应用前景进行了展望。

1 细胞凋亡与磷脂外翻

细胞凋亡程序通过内源或外源性途径启动之后，凋亡细胞自身会产生一系列的病理生理改变[5]，如磷脂外翻、Caspase级联反应激活、细胞膜印迹的改变、线粒体膜电位消失等，这些变化都可被作为可识别的、特异性的生物靶标，通过放射性核素标记化合物与凋亡细胞中特异靶标结合的特性，即可进行细胞凋亡的活体无创显像。

细胞膜的内膜外翻是细胞凋亡在分子水平的重要特征之一。在活细胞中，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)位于哺乳动物细胞膜内侧小叶，并占了细胞膜内膜上磷脂类很大一部分比例，而外侧小叶主要含有磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)和鞘磷脂。细胞发生凋亡时，细胞膜内侧的PS和PE能够随着细胞膜双磷脂层的重分布或反转而出现在细胞膜表面。PS和PE的这种跨膜翻转特点使得它们成为适合的分子显像靶点。

当今，以磷脂外翻为靶点的活体内检测细胞凋亡的研究主要集中于靶向PS的显像剂[5]。目前已经发现膜联蛋白(Annexin)、突触结合蛋白C2A片段和Zn2+-双(2-吡啶甲基)胺(Zn2+-DPA)等可以与细胞外膜表面的PS特异性结合。其中，放射性核素标记的膜联蛋白是研究较为广泛的凋亡显像剂。然而，由于膜联蛋白相对分子质量较大，导致该显像剂血液清除较慢、信噪比低、早期显像效果不佳；另外，制备成本高、结合特异性差和具有免疫原性等缺点也阻碍了其在临床上的应用[6]。

在哺乳动物细胞膜中，PE的含量约占总磷脂的20%～50%，而PS仅占总磷脂的2%～10%[7]。因此，与PS相比，PE作为细胞凋亡显像的靶点，潜在的结合位点更多，有利于提高探针在凋亡细胞中的摄取，具有明显的优势。

2 耐久霉素作为PE的探针

耐久霉素(Duramycin)是由肉桂色链轮丝菌产生的羊毛硫抗生素B家族的成员之一，是由19个氨基酸残基组成的四环多肽，相对分子质量为2013，其分子内有三个硫醚键连接，还有一个独特的赖氨酸丙氨酸环[8]，其整个结构呈一个紧凑的环形，结构图示于图1。耐久霉素与PE结合的部位为7位苯丙氨酸至14位半胱氨酸的亲脂侧链，15位天冬氨酸的羧基与PE头部的氨基发生离子相互作用而紧密结合。此外，另有两个苯丙氨酸侧链锚定磷脂双分子层的疏水区，使两者结合更加稳定。耐久霉素的解离常数可以达到纳摩尔级(4～6 nM)，以1∶1比例与PE分子的头部高特异性的结合。耐久霉素曾在临床中用于治疗囊性纤维化，从耐久霉素的临床实际应用中可以看出其没有明显的毒性和免疫原性[9-10]。

图1 耐久霉素的结构Fig.1 Chemical structure of Duramycin

耐久霉素具有许多结构特征及性质[11]，使其可用于PE的分子成像：(1) 耐久霉素能够特异性的与PE结合，且不与其他密切相关的磷脂物种(如PC、PS、磷脂酰肌醇)发生交叉反应；(2) 与典型的线状多肽和大蛋白相比，其多肽序列较短，相对分子质量较低，能够快速的从血液和非靶器官中清除，背景信号低，有利于成像性能的优化；(3) 与蛋白质探针相比，具有更好的组织穿透性；(4) 耐久霉素具有“精心设计”的结合口袋，其周围的关键氨基酸残基可以立体定向识别PE；(5) 分子内由多个共价键连接，没有游离的肽末端，这种结构使得耐久霉素可以抵抗血液蛋白酶和肽酶的降解，具有更高的体内稳定性；(6) 耐久霉素1位半胱氨酸(Cys)和2位赖氨酸(Lys)的伯胺远离结合口袋，它们既能提供潜在的生物结合和标记位点，又不影响与PE的结合。

目前已有研究将耐久霉素进行荧光素[12-13]或者生物素[12,14]标记，作为PE的探针，利用荧光显微镜或者流式细胞仪来检测细胞凋亡情况，然而这些方法均具有一定的局限性，如荧光组织穿透深度较低、生物素的特异性较差等。

3 放射性核素标记的耐久霉素

放射性核素显像的组织穿透能力更强，敏感性也更高，因此，在临床中的应用更广。目前放射性核素标记耐久霉素的凋亡显像探针主要分为两类，分别是基于正电子发射断层显像(PET)的正电子类显像剂和基于单光子发射计算机断层显像(SPECT)的单光子类显像剂，以下主要对这两类显像探针的研究进展进行综述。

3.1 正电子核素标记的耐久霉素

与SPECT相比，PET的分辨率和敏感性更高，更易于定量分析，使用正电子核素18F、68Ga标记的耐久霉素均有报道。

3.1.118F标记的耐久霉素 Yao等[15]通过4-硝基苯基-2-[18F]氟代丙酸酯(18F-NFP)来进行耐久霉素的18F标记。从18F离子起始合成18F-NFP共需80 min，未经衰变矫正，放化收率为(25±5)%(n=10)；以18F-NFP为原料合成至18F-FP-Duramycin共需20 min，未经衰变矫正，放化收率为(70±3)%(n=8)，终产物18F-FP-Duramycin的放化纯度大于99%，比活度为(23.7±13.7) GBq·μmol-1(n=10)。在小鼠的生物分布实验中，18F-FP-Duramycin表现出了高血浆和肾脏清除率，经尾静脉注射后 120 min测定，其主要蓄积在肝脏和脾脏中。荷瘤鼠经治疗后注射18F-FP-Duramycin，1 h后行PET 显像。荷S180肿瘤裸鼠在治疗前后的肿瘤摄取分别为(0.87±0.1)%ID/g和(1.3±0.1)%ID/g，荷A549肿瘤裸鼠在治疗前后的肿瘤摄取分别为(1.1±0.2)%ID/g和(1.7±0.1)%ID/g。小动物 PET 显像实验表明，18F-FP-Duramycin可成功检测到动物体内肿瘤治疗引起的细胞凋亡过程。但18F-FP-Duramycin合成过程复杂，不利于实现自动化合成，而且其在肝脏和脾脏的放射性摄取较高，这种高背景信号限制了其在腹部区域成像的应用。

Haskali等[16]采用糖氨基酸对18F-FP-Duramycin显像剂进行了结构优化，合成了18F-FP-galacto-Duramycin和18F-FP-digalacto-Duramycin。研究结果表明，18F-FP-galacto-Duramycin和18F-FP-digalacto-Duramycin的Log D7.4(探针在pH=7.4的PBS缓冲液和正辛醇体系中的脂水分配系数)分别为-0.52±0.04和-2.6±0.04，与18F-FP-Duramycin(Log D7.4为-0.22±0.05)相比，水溶性明显增加。正常鼠注射18F-FP-digalacto-Duramycin后110 min行PET显像，结果显示，18F-FP-digalacto-Duramycin在肾脏和膀胱中的摄取明显增高，但是肝脏摄取依然很显著。

Yuan等[17]采用Al[18F]F标记法合成了Al[18F]F-NOTA-PEG3-Duramycin，合成过程只需30 min，未经衰变矫正，放化收率为(21.3±2.6%)(n=10)，放化纯度大于99%，比活度为(5.3±1.5)GBq·μmol-1(n=10)。正常小鼠生物分布结果表明，Al[18F]F-NOTA-PEG3-Duramycin在体内分布迅速，血液清除率高。在脑中的摄取最低，这表明其没有穿过血脑屏障。18F-FP-Duramycin在5 min和2 h时，肝脏中的摄取分别为(39.7±6.5)%ID/g和(11.9±0.9)%ID/g。与18F-FP-Duramycin相比，Al[18F]F-NOTA-PEG3-Duramycin肝脏摄取明显降低，分别为(8.52±1.4)%ID/g和(4.96±1.0)%ID/g。这一结果表明，引入PEG3基团可以提高其水溶性，降低其在肝脏中的摄取。但是，其在肾脏中的滞留很高，在30 min和2 h时，分别为(14.31±3.1)%ID/g 和(10.95±1.9)%ID/g，而18F-FP-Duramycin在30 min和2 h时的肾脏摄取分别为(4.64±0.2)%ID/g和(1.14±0.1)%ID/g。荷HCC827肿瘤裸鼠经靶向药物Erlotinib治疗后6 h经尾静脉注射Al[18F]F-NOTA-PEG3-Duramycin，1 h后行PET/CT显像，结果显示，肿瘤摄取为(2.96±0.25)%ID/g，与治疗前(0.89±0.15)%ID/g相比，摄取值增加了2倍。

3.1.268Ga标记的耐久霉素68Ga是一种优良的正电子核素，半衰期为68 min，且可通过发生器方便的获得。黄斌等[18]以正电子核素68Ga通过螯合剂NOTA标记Duramycin，合成了68Ga-NOTA-Duramycin，标记率为(92.5±2.1)%，放化纯度>90%，体外稳定性良好。正常小鼠体内生物分布研究表明，注射后5 min，68Ga-NOTA-Duramycin在血液、心、肝、脾、肺有少量放射性摄取，但清除较快；肾放射性摄取较多，随时间延长，双肾放射性摄取减少，表明该显像剂主要经肾脏排泄。在猪心肌缺血再灌注损伤模型中，注射68Ga-NOTA-Duramycin 1 h后行PET显像，结果显示缺血组织呈异常局灶性放射性浓聚，与凋亡体外病理检测结果一致。

Anne 等[19]还以NODAGA为双功能螯合剂，制备了68Ga-NODAGA-Duramycin。68Ga-NODAGA-Duramycin在体内快速分布，在血液和肝脏中初始示踪剂浓度最高。血液半衰期为10.10±9.25 min，血液清除快，在2 h内，大部分示踪剂已从体内清除。68Ga-NODAGA-Duramycin在肝脏和肾脏有滞留，经肾代谢后积聚在膀胱里。在检测化疗引起的器官毒性实验中，注射68Ga-NODAGA-Duramycin后2 h通过PET/CT成功检测到化疗引起的组织毒性，并通过免疫组织化学和血液参数分析证实。

3.2 单光子核素标记的耐久霉素

3.2.199mTc-HYNIC-Duramycin的制备及生物分布 SPECT中常用的同位素有99mTc、123I、111In等，目前报道的仅有99mTc标记的耐久霉素。99mTc发射纯 γ 射线，半衰期 6.02 h，其理化性质良好、方便易得，是核医学显像检查中最常用的放射性核素。HYNIC (6-hydazinonicotinic acid)是99mTc标记化合物最常用的双功能螯合剂之一，其标记速度快、产率高、标记物稳定性好。

图2 99mTc-HYNIC-Duramycin的结构Fig.2 Chemical structure of 99mTc-HYNIC-Duramycin

2008年，Zhao等[20]首次描述了99mTc-HYNIC-Duramycin的制备方法，99mTc-HYNIC-Duramycin的结构示于图2。耐久霉素的分子结构呈一个紧凑的环形，分子中有两个伯胺， 其中1位Cys上的伯胺位于环形内侧，而2位Lys上的伯胺位于环形外侧。在耐久霉素和HYNIC偶联的过程中，可能会有三个产物，分别是1位Cys偶联HYNIC、2位Lys偶联HYNIC以及1、2位氨基酸都偶联HYNIC的产物。其中，1、2位氨基酸都偶联HYNIC的产物Di-HYNIC-Duramycin可以通过HPLC纯化除去，而1位Cys偶联HYNIC、2位Lys偶联HYNIC的产物HYNIC-Duramycin无法通过HPLC分离，是一对异构体。由于立体位阻的原因，导致2位Lys上的伯胺反应活性高于1位Cys的伯胺，因此，Zhao等推断HYNIC-Duramycin主要是2位Lys偶联HYNIC的产物。HYNIC-Duramycin是一种稳定的复合物，在还原剂氯化亚锡存在的情况下，以三苯基膦三磺酸钠(TPPTS)和三羟甲基甘氨酸(tricine)作为协同配体可与99mTc快速有效的进行反应。为了简化标记过程，随后Zhao等[21]对配方进行了优化，成功研制了一步法标记99mTc-HYNIC-Duramycin的药盒，高锝酸钠的用量为1.1～1.5 GBq，在80 ℃下孵育20 min，即可快速可靠地得到放化纯度大于90%的99mTc-HYNIC-Duramycin。细胞结合实验结果表明[20]，和对照组相比，99mTc-HYNIC-Duramycin与用喜树碱诱导凋亡的 Jurkat淋巴细胞的结合显著增强。在含有PE的脂质体浓度增加的情况下，这种结合被竞争性地消除。然而，由PC、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol)或PS组成的脂质体并不能竞争性地降低99mTc-HYNIC-Duramycin在凋亡细胞中的放射性摄取。这些结果表明，标记过程对耐久霉素的结构和生物活性没有影响。在正常大鼠体内生物分布实验结果显示99mTc-HYNIC-Duramycin静脉注射后主要经肾脏快速排泄，血液半衰期小于4 min，肝脏和胃肠道的摄取较低。凋亡细胞对99mTc-HYNIC-Duramycin的摄取超过正常活细胞摄取的30倍。

然而，Elvas等[22]使用经药盒制备的99mTc-HYNIC-Duramycin进行实验时，发现其在小鼠血液中清除速度较慢，脾脏和肝脏摄取较高。于是，他们又对99mTc-HYNIC-Duramycin的纯化方法进行了研究。结果发现，与未经纯化或者固相萃取(SPE)纯化后的99mTc-HYNIC-Duramycin相比，经过HPLC纯化后的99mTc-HYNIC-Duramycin在凋亡肿瘤细胞的摄取更高，而且降低了脾脏和肝脏的摄取。他们推测在耐久霉素的药盒中存在过量的标记前体HYNIC-Duramycin，可能与99mTc-HYNIC-Duramycin竞争性的结合凋亡细胞中的PE，另外可能对99mTc-HYNIC-Duramycin的生物分布和排泄动力学也有一定的影响，而HPLC纯化可以有效分离标记物与标记前体，因此得到更理想的结果。

3.2.299mTc-HYNIC-Duramycin在肿瘤治疗疗效评估中的应用 在放射性核素标记的耐久霉素中，99mTc-HYNIC-Duramycin是生物学分布和辐射剂量比较理想的一种放射性药物。99mTc-HYNIC-Duramycin凋亡显像应用范围广泛，如心肌缺血再灌注损伤[20,21,23-25]、冠状动脉粥样斑块[25-29]、脑缺血性损伤[24]、电离辐射损伤[29-30]、肺缺氧损伤[31]以及肿瘤治疗疗效的早期评估等，其中最有潜力的应用就是对肿瘤治疗疗效的早期评估。在临床上，肿瘤的早期疗效评估可以区分应答患者和无反应患者，从而最大限度地减少因无效治疗而产生的全身毒性，并利于临床及时调整治疗策略，从而提高患者生存率并减少医疗成本的优势。以下将主要介绍99mTc-HYNIC-Duramycin在肿瘤早期疗效评估中的应用。

1) 在靶向治疗疗效评估中的应用

Elvas等[32]用99mTc-HYNIC-Duramycin观察荷结肠癌COLO205模型鼠经单克隆抗体conatumumab靶向治疗诱导细胞凋亡情况。治疗后24 h注射99mTc-HYNIC-Duramycin，4 h后行SPECT显像。治疗前，肿瘤/肌肉和肿瘤/血液摄取值比为分别为(4.45±0.92)和(1.83±0.32)。经过conatumumab一个疗程的靶向治疗后，肿瘤/肌肉和肿瘤/血液摄取值比为分别为(30.80±1.89)和(14.93±1.32)，治疗后肿瘤摄取值是治疗前肿瘤摄取值的7倍，凋亡的肿瘤组织在SPECT图像中呈现“高亮”区域，与周围组织对比度高。然而，conatumumab治疗无效的HT29肿瘤，在治疗前后，99mTc-HYNIC-Duramycin的摄取水平均较低，这与细胞凋亡诱导的缺乏相对应。

18F-FDG是监测肿瘤治疗反应的临床金标准，可反映肿瘤细胞中葡萄糖的代谢水平，18F-FDG明显降低往往意味着有效的治疗，但18F-FDG并不是肿瘤的特异性显像剂。在此研究中[32]，同样用18F-FDG对肿瘤治疗的疗效进行了评估。无论是治疗敏感的COLO205肿瘤，还是治疗无效的HT29肿瘤，在conatumumab一个疗程的靶向治疗后，18F-FDG摄取都没有明显的变化。这一结果表明，对于18F-FDG低亲和力的恶性肿瘤，99mTc-HYNIC-Duramycin凋亡显像可作为评价治疗反应的一种潜在替代策略。

2) 在化疗疗效评估中的应用

Elvas等[33]采用化疗药物依立替康治疗荷结肠癌COLO205模型鼠，治疗后24 h注射99mTc-HYNIC-Duramycin，4 h后行SPECT显像，监测肿瘤对治疗的反应。在依立替康治疗一个周期后，99mTc-HYNIC-Duramycin的摄取为(1.62±0.07)%ID/mL，可以检测到肿瘤对治疗的反应。99mTc-HYNIC-Duramycin同样也适用于多药联合治疗肿瘤凋亡成像。奥沙利铂与依立替康联合治疗荷结肠癌COLO205模型鼠后，放射性示踪剂的摄取进一步增加，为(2.61±0.46)%ID/mL,是空白对照组的2.8倍，并与肿瘤的凋亡反应呈正相关，而预先注射未标记的耐久霉素可以成功地阻断肿瘤对99mTc-HYNIC-Duramycin摄取。

Li等[34]将荷乳腺癌MDA-MB-468模型小鼠随机分为治疗组和空白对照组，应用99mTc-HYNIC-Duramycin监测经顺铂化疗前后的细胞凋亡情况。第1组在治疗前和治疗后24 h注射99mTc-HYNIC-Duramycin，4 h后用小动物SPECT/CT评价治疗效果。顺铂治疗3天后，治疗组肿瘤中的99mTc-HYNIC-Duramycin摄取量(7.89±0.62)%ID/g明显高于对照组(1.69±0.58)%ID/g，且治疗后与治疗前有显著性差异。治疗前，肿瘤/肌肉(T/M)和肿瘤/血液(T/B)摄取值比为分别为(3.64±1.03)和(1.98±0.65)；治疗之后，T/M和T/B分别为(17.69±2.56)和(9.56±1.62)。此外，对肿瘤体积的动态观察发现，直到治疗后第8天，肿瘤开始缩小，晚于通过99mTc-HYNIC-Duramycin显像可作出诊断的时间，这进一步证实99mTc-HYNIC-Duramycin可在治疗初期即对疗效做出正确评价。

Luo等[35]建立了荷MDA-MB-231乳腺癌细胞的雌性Balb/c小鼠模型，采用紫杉醇化疗诱导细胞凋亡72 h后，注射99mTc-HYNIC-Duramycin，2 h后检测细胞凋亡情况。结果表明，紫杉醇治疗组肿瘤与肌肉(T/M)的比值(5.29±0.62)明显高于对照组(2.48±0.89)。经紫杉醇治疗后，肿瘤体积明显缩小，而99mTc-HYNIC-Duramycin摄取明显增加，与凋亡指数、组织学改变和超微结构改变的趋势一致。

3) 在放疗疗效评估中的应用

单纯放疗或联合化疗是肿瘤常用的治疗方式。电离辐射通过激活caspase级联反应而诱导癌细胞凋亡，而在体外γ射线照射后，PS和PE在细胞膜中同时外翻。Elvas等[33]证实了99mTc-HYNIC-Duramycin在检测放疗诱导肿瘤细胞凋亡方面的能力。荷结肠癌COLO205模型鼠经过4.5 Gy放疗24 h后注射99mTc-HYNIC-Duramycin，4 h后进行小动物SPECT/CT显像。结果表明，治疗组99mTc-HYNIC-Duramycin的摄取比对照组增加了2倍。最后一次放疗后，组织学分析显示照射诱导肿瘤细胞凋亡。因为放疗后细胞凋亡水平的增加程度通常相对较小，敏感性是临床试验中细胞凋亡靶向剂的一个主要衡量指标。尽管放疗后肿瘤细胞凋亡水平较低，但99mTc-HYNIC-Duramycin仍有足够的敏感性可检测到肿瘤对治疗的反应。

4 结论

综上所述，细胞凋亡在肿瘤研究中具有重要意义, PE在细胞凋亡早期暴露在细胞膜表面，可以作为细胞凋亡显像的靶点。耐久霉素可以与PE特异性结合，是检测细胞凋亡的灵敏探针。利用放射性核素对耐久霉素标记后，通过其与PE的结合，可以活体检测细胞凋亡。

在放射性核素标记的耐久霉素中，对99mTc-HYNIC-Duramycin的研究最为广泛，包括标记、药盒化、纯化、动物实验等，多项动物实验研究表明，其在肿瘤影像学和疗效评价方面都具有潜在的临床应用价值。然而，将动物研究转化为临床实践仍面临许多挑战，比如，在患者治疗后进行放射性标记耐久霉素的最佳显像时间和最佳注射剂量还需要深入研究。与SPECT相比，PET的分辨率和敏感性更高，已有学者使用18F、68Ga等正电子核素来标记耐久霉素，但是现阶段其体内的生物学特征并不理想，还有待进一步的优化。

目前放射性核素标记的耐久霉素都还处于动物实验研究阶段，我们期待这种新型的分子影像探针能够早日进入临床应用，在疾病诊断特别是肿瘤的早期疗效评估方面取得突破性的进展。