活血通脉胶囊抗凝血酶活性生物效价测定法的建立

高天红，朴晋华 ，董培智，张志伟，王婷婷

(山西省食品药品检验所，山西 太原 030031)

活血通脉胶囊为水蛭经加工制得的胶囊剂，具有破血逐瘀、活血散瘀、通经、通脉止痛的功效。收载于《新药转正标准》第十七册，质量标准仅采用茚三酮显色反应定性、氮测定法定量，专属性差，且含量多少与临床疗效无关联性，无法真正有效评价活血通脉胶囊的内在质量。水蛭是水蛭科动物蚂蟥WhitmaniapigraWhitman、水蛭HirudonipponicaWhitman或柳叶蚂蟥WhitmaniaacranulataWhitman的干燥全体，可破血通经，逐瘀消癓[1]，它能减缓纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程，阻止凝血酶催化的血瘀反应，抑制凝血酶与血小板结合[2]，《中国药典》2015年版一部采用凝血酶滴定法(Markwardt 法)对其含量进行控制，但测定结果滴定体积小、影响因素多，可靠性和准确性存在不足[3]。

琼脂糖-纤维蛋白原平板法(沉淀法)将琼脂凝胶为介质的沉淀反应与生物活性测定方法有机结合，以纤维蛋白原为底物，大分子物质-酶在琼脂凝胶中扩散与底物结合成复合物，可形成特异性沉淀环，沉淀环直径与酶的浓度相关[4]。本文基于水蛭素的生物效应，分别对Markwardt 法、琼脂糖-纤维蛋白原平板法(沉淀法)测定水蛭和活血通脉胶囊的生物效价进行比较研究，筛选得出经济、简单、精确的水蛭素生物效价测定方法，为活血通脉胶囊抗凝血酶活性生物效价测定法的建立，提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 试剂牛凝血酶：中国食品药品检定研究院，190 BP，批号：140605-200424、140605-200426；160 BP，批号：140605-201526；牛纤维蛋白原：中国食品药品检定研究院，98 mg可凝蛋白，批号：140607-200736；103 mg可凝蛋白，批号：140607-201740；水蛭素标准品：中国食品药品检定研究院制备，效价 13 000 ATU。琼脂糖粉：Solarbio、上海楷洋生物技术有限公司，三羟甲基氨基甲烷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，均为分析纯。

1.2 药品活血通脉胶囊：每粒装0.25 g，山西云中制药有限责任公司，批号：样品1、样品2、样品3；水蛭(蚂蟥WhitmaniapigraWhitman和柳叶蚂蟥WhitmaniaacranulataWhitman，清水吊干)粗粉，过三号筛，山西云中制药有限责任公司。

1.3 试验仪器恒温培养箱，上海恒科科研仪器有限公司。

1.4 供试品溶液的制备水蛭：取粉末适量，精密称定，加 0.9%氯化钠溶液浸提 30 min，定容。4 000 r·min-1离心 5 min，精密量取上清液并配成不同浓度的稀释液。

活血通脉胶囊：取活血通脉胶囊内容物适量，研细，精密称定，加 0.9% 氯化钠溶液浸提30 min，定容。 4 000 r·min-1离心5 min，精密量上清液取并配成不同浓度的稀释液。

1.5 不同抗凝血酶生物活性效价测定方法的考察

1.5.1Markwardt 法(凝血酶滴定法) 精密量取供试品溶液100 μL，加入含 0.5% 牛纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH 7.4)200 μL，置水浴(37 ± 0.5 ℃)中，缓缓滴加30 000 BP·L-1凝血酶溶液至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积并计算。同时考察不同操作人员，不同时间及不同凝血酶对结果的影响。结果见Tab 1。

1.5.2琼脂糖-纤维蛋白原平板法(沉淀法)[5]取凝血酶标准品，用 0.9% 氯化钠溶液制成含不同凝血酶单位的溶液。琼脂糖加水配置成2% 的溶液。纤维蛋白原用 pH 7.5的 Tris-HCl 溶液配成 0.1% 的溶液，加入 90 ℃左右的琼脂糖溶液(1 ∶1)，倒入培养皿，室温放置 30 min打孔。取供试品溶液适量与 20 000 BP·L-1标准凝血酶溶液反应 10 min，精密量取反应后的供试品溶液及凝血酶标准品溶液各 20 μL，分别点在同一平皿中，放置 37 ℃ 18 h。测量沉淀圈垂直直径，计算沉淀圈面积，利用凝血酶标准曲线计算供试品与凝血酶反应后效价单位(BP)，得到供试品中水蛭素的效价(ATU)。

水蛭素的生物效价(ATU)=(20 000 BP·L-1-剩余凝血酶活力BP·L-1)×稀释倍数

1.5.3统计学方法 Markwardt 法采用容量分析法，琼脂糖-纤维蛋白原平板法(沉淀法)采用标准曲线法。

1.6 抗凝血酶活性生物效价测定法的建立与验证[6-8]

1.6.1测定方法建立 按1.5方法筛选试验结果，选择活血通脉胶囊抗凝血酶活性生物效价的测定方法。

1.6.2试验系的考察 分别采用不同溶剂，同种溶剂不同提取方法、温度和时间， 提取 1 g 活血通脉胶囊中的水蛭素，测定其效价。并对培养 8 和 18 h 的平板进行考察。

1.6.3方法学验证

1.6.3.1 专属性考察 分别制备活血通脉胶囊阴性对照样品和空白回收样品，按“1.6.1”试验方法和“1.6.2”确定的试验条件测定其效价。

1.6.3.2 标准曲线的制备 取凝血酶标准品加0.9% 氯化钠溶液溶解，并稀释成 5 000、7 500、10 000、150 000、20 000 BP·L-1的系列活力浓度，分别精密吸取上述标准品溶液20 μL 点样，测量沉淀圈直径。测定结果见Fig 1。

Fig 1 Thrombin standard curve

1.6.3.3 中间精密度考察 取供试品溶液(样品3)，分别改变实验室内部条件(不同人员、不同时间)，按“1.6.1”试验方法和“1.6.2”确定的试验条件，测定其效价。

1.6.3.4 重复性考察 取供试品溶液(样品3)6 份，按“1.6.1”试验方法和“1.6.2”确定的试验条件测定其效价。

1.6.3.5 回收率试验 采用加样回收法，取已知含量活血通脉胶囊样品(批号：样品3，效价：62.403 U·g-1)，研细，称取 6 份，(每份约0.500 g)，分别精密称定，再精密量取水蛭素标准品(1 000 ATU·L-1) 60 μL分别加入样品中，按“1.6.1”试验方法和“1.6.2”确定的试验条件测定其效价，并计算回收率。

1.6.3.6 溶液稳定性试验 取储存于4 ℃ 下同一供试品溶液(样品3)，分别在制备后0、24、48、72 h 点样，测定其效价。

1.6.3.7 耐用性试验 按“1.6.1”试验方法分别选用进口及国产琼脂糖制备平板，在两板相应位置点同样的样品，观察不同来源的琼脂糖对实验结果的影响。

1.6.4样品测定 取3批活血通脉胶囊样品(样品1、样品2、样品3)，按1.4制备供试品溶液，按“1.6.1”试验方法和“1.6.2”确定的试验条件测定其效价，每样品重复测定3次。

2 结果

2.1 不同抗凝血酶生物活性效价测定方法的考察

2.1.1Markwardt 法(凝血酶滴定法) Tab 1结果显示，不同批号凝血酶、不同试验时间及不同试验人员测定同批水蛭和活血通脉胶囊抗凝血酶活性，RSD分别为 15.6%、12.9%。凝固情况分为两种：局部形成凝块后不再凝结和全部凝结，且滴定终点凝块的形成随着摇晃的力度和速度变化而变化，终点不易判断。

Tab 1 Results of Markwardt bioassay of leech and Huoxuetongmai capsule

2.1.2琼脂糖-纤维蛋白原平板法(沉淀法) Tab 2结果可见，不同试验人员分别测定，水蛭和活血通脉胶囊抗凝血酶活性RSD分别为 3.5%、5.2%。

Tab 2 Results of fibrinogen bioassay of leech and Huoxuetongmai capsule

2.1.3不同测定方法的比较 琼脂糖-纤维蛋白原平板法(沉淀法)测定水蛭和活血通脉胶囊抗凝血酶生物效价的中间精密度RSD分别为3.5%、5.2%，优于Markwardt法(RSD分别为15.6%、12.9%)。且测量指标易于量化，更加客观。故选择琼脂糖-纤维蛋白原平板法(沉淀法)，建立活血通脉胶囊抗凝血酶活性生物效价的测定方法。

2.2 活血通脉胶囊抗凝血酶活性生物效价测定法的建立与验证

2.2.1试验系的考察

2.2.1.1 供试品溶液处理方法的考察 试验结果显示0.9% 氯化钠溶液提取效果好于水，5 mL 和10 mL 0.9% 氯化钠溶液提取1 g活血通脉胶囊的水蛭素含量一致，10 mL 0.9% 氯化钠溶液超声 30 min 提取与浸泡 30 min 提取的水蛭素含量一致，10 ℃ 冷浸30 min 提取与常温(30 ℃)浸泡30 min 提取的水蛭素含量一致，30 min 提取液与 4 h 提取液水蛭素含量一致。

综合考虑到经济、节约、效能等因素，以0.9% 氯化钠溶液为提取试剂，以 100 g·L-1比例、常温浸提 30 min 提取供试品中的水蛭素。

2.2.1.2 不同培养时间考察 培养8 h 形成的沉淀圈不规则、不同剂量间无明显差别；培养18 h 后沉淀圈形状规则便于测量，选择培养18 h。

2.2.2方法学验证

2.2.2.1 专属性考察 阴性对照样品沉淀圈大小与凝血酶标准对照一致，空白回收样品沉淀圈与样品一致，阴性对照样品对实验结果无干扰。

2.2.2.2 纤维蛋白原平板法凝血酶标准曲线的制备 以凝血酶标准品活力浓度为横坐标，沉淀圈面积为纵坐标计算回归方程。结果表明，凝血酶浓度5～20 BP 范围内，回归方程 Y=40.9 + 4.94X，R2=0.994。可用于活血通脉胶囊中水蛭素效价的计算。见Fig 1。

2.2.2.3 中间精密度考察 取供试品溶液(样品3)，分别改变实验室内部条件(不同人员、不同时间)，测定样品中水蛭素的效价，结果中间精密度 RSD 为 3.2%。

2.2.2.4 重复性考察 供试品溶液(样品3)6 份，测定样品中水蛭素的效价。结果重复性考察 RSD 为4.7%。

2.2.2.5 回收率试验 结果见Tab 3，本法平均回收率为 98.26% (n=6)，RSD 为 2.3%。

Tab 3 Recovery test results

2.2.2.6 溶液稳定性考察 储存于4 ℃ 下供试品溶液，分别在制备后0、24、48、72 h点样，测定其效价，供试品溶液在4 ℃ 下72 h 内稳定。

2.2.2.7 耐用性 相应位置上，使用进口琼脂糖的平板沉淀圈明显小于使用国产琼脂糖的平板，显示不同来源和批号的琼脂糖对本法测定结果有影响。

2.2.3 供试品测定Tab 4结果可见，三批供试品的效价测定结果分别为70.355、61.485、62.357 ATU·g-1；RSD分别为 5.0%、3.2%、4.7%。

Tab 4 Titer test results of three batches of samples

3 讨论

水蛭始见于《神农本草经》，是破血逐淤类经典中药。其生物活性物质多样，依药理作用可大致分为两类，一类直接作用于凝血系统，如水蛭素、吻蛭素、类肝素等；另一类为其他蛋白酶抑制剂组分，如Decorsin、Hementin等。具有抗凝、抗血栓、抗肿瘤、抗细胞凋亡等多种药理作用[9]，主要成分水蛭素是已知作用最强的凝血酶特异性抑制剂。纤维蛋白原在凝血酶的作用下生成纤维蛋白，继而形成凝胶，这是血液凝固的基本过程，通过观察药物对凝血酶与纤维蛋白原水解反应的影响，可以评价药物的抗凝血酶作用。

凝血酶是在生理状态下唯一能将大量蛋白 C(PC)转化为 APC 的丝氨酸蛋白酶，通过裂解纤维蛋白原，形成纤维蛋白单体，活化血小板，激活抗凝系统蛋白 C，在凝血过程中起重要作用。水蛭素可作用于凝血酶的非活性底物识别位点和酶活性中心识别位点，1 ∶1结合形成不可逆复合物，使后者失去活性[10]。其与血浆中的游离凝血酶结合速度比纤维蛋白原快，同时可中和与纤维蛋白结合的凝血酶。

目前水蛭素活性测定方法有 Markwardt 法，Chromozym TH 发色底物法，光散射法，纤维蛋白原平板法等。其中Chromozym TH 发色底物法和光散射法需配备进口试剂及仪器设备，成本较高，不利于推广使用。

Markwardt法是《中国药典》2015年版水蛭的含量测定方法，利用水蛭素与凝血酶反应速度较纤维蛋白原快，反应呈正比关系，选用适宜的滴定浓度，终点时稍过量凝血酶使纤维蛋白原产生凝固。血液凝固是一个连续过程，初凝出现的微量凝胶为透明状，肉眼难以观察，滴定终点也要靠试验者的主观判断；同时有研究显示，在滴定间隔时间和滴定时间固定的情况下，凝血酶单次滴加量不同，实验结果有明显差别[11]。本研究选用滴定浓度 30 000 BP·L-1，滴定中每隔1 min摇动，不利于形成纤维蛋白凝胶。其滴定过程不易控制，滴定终点不易观察，易受环境温度、人员操作熟练程度等的影响。同时结果用容量分析方法进行计算，误差较大。该法测定的水蛭和活血通脉胶囊的抗凝血酶活性中间精密度RSD分别为 15.6%、12.9%。

琼脂糖-纤维蛋白原平板法是将标准凝血酶及经水蛭素1 ∶1抑制后的凝血酶滴加到琼脂糖-纤维蛋白原平板加样孔内，凝血酶在扩散过程中与纤维蛋白原形成酶-底物复合物，使纤维蛋白原水解，并发生交联呈乳白色沉淀，在一定范围内沉淀圈直径与凝血酶活性呈正相关，利用标准曲线，可经水蛭素抑制后剩余凝血酶的量，计算水蛭素的效价[12]。其评价指标与活血通脉胶囊功能主治相关，方法准确简便、影响因素少、易于操作，具有较好的精密度和重复性，符合中药生物活性测定的基本原则。耐用性试验提示使用进口琼脂糖的平板沉淀圈较国产琼脂糖小，考虑到采用了标准曲线法，且供试品和凝血酶标准品的免疫扩散可同时在一块纤维蛋白原平板上进行,有助于提高耐用性, 减少实验误差。

在琼脂糖-纤维蛋白原平板法(沉淀法)测定结果统计方法的选择中，考虑量反应平行线法的一般原则是标准品应和样品同质，活血通脉胶囊除水蛭素外，还包括类肝素、组织胺及多种其他蛋白酶抑制剂，从多个环节影响血液凝固、促进纤溶，故未采用量反应平行线法。 单点法测量沉淀圈直径或面积计算效价，结果易受试剂如纤维蛋白和凝血酶、点样误差、平板制备等多种因素影响，重现性较差。故研究采用标准曲线法测定抗凝血酶生物效价，以有效控制实验误差。