基于PKD1/HDAC7轴研究丹参酚酸B对大鼠缺血心肌组织的保护作用

刘 暖，杨 雷，刘 萍

(南阳理工学院河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室，河南 南阳 473004)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)等缺血性疾病会引发大量心肌细胞死亡，导致患者左心室不良重构、心功能受损、生活质量低下[1]。丹参为治疗MI等缺血性心肌疾病的经典中药材之一，丹参酚酸B(salvianolic acid B，SAB)属于水溶性酚酸类化合物，为丹参的代表性单体成分[2]。课题组前期的实验研究证实，蛋白激酶D1(protein kinase D1，PKD1)具有促进血管新生的作用[3-4]，并且可以下调MI后心肌胶原蛋白的表达，进而逆转MI后的心室重塑，保护缺血受损的心肌[5]。PKD1在体内发挥上述对缺血心肌的部分保护效应需要依赖和IIa类组蛋白去乙酰化酶7(group IIa histone deacetylase 7，HDAC7)的结合，形成PKD1/HDAC7轴才能够完成[6]。CID755673为PKD1的特异性阻断剂。本研究拟分析MI大鼠SAB给药及应用阻断剂14 d后心肌组织的形态学变化及PKD1和HDAC7蛋白的表达，阐述SAB是否通过调控PKD1/HDAC7轴保护缺血受损的心肌组织。

1 材料

1.1 实验动物40只Wistar大鼠，SPF级，♂，8周龄，体质量(200±20)g，购自北京维通利华公司，动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0011；动物质量合格证号:11400700315978。

1.2 药物与试剂SAB(上海陶素公司，批号:115939-25-8)，CID755673(简称CID，美国MCE公司，批号:2018276)；TUNEL染色试剂盒(上海翊圣公司，批号:40308ES20)；PKD1(上海圣克鲁斯公司，批号:Sc-1796)、HDAC7(武汉三鹰生物公司，批号:DF6435)的一抗抗体；Cy3荧光标记的羊抗兔IgG二抗(武汉博士德公司，批号:BA1032)；其它试剂为国产分析纯。

1.3 主要仪器LSM 800激光共聚焦显微镜和ZEN 2.3 lite分析软件(德国蔡司公司)；CUT6062病理切片机和MTMI全密闭自动脱水机(德国赛利公司)。

2 方法

2.1 动物造模大鼠随机分为假手术组(Sham)、心梗模型组(MI)、SAB给药组(SAB)和CID阻断剂组(CID)。结扎左冠状动脉前降支复制MI模型，Sham组不进行结扎操作，其他手术程序和MI组保持一致。14 d实验周期中，大鼠均腹腔注射给药，具体给药剂量为:SAB组:50 mg·kg-1·d-1，CID组:50 mg·kg-1·d-1SAB+40 μg·kg-1·d-1CID，Sham和MI组:等量生理盐水。14 d后，处死大鼠，进行检测分析。

2.2 HE染色将处死后大鼠的心脏剪取左心室，含室间隔部分，参照之前的方法[3]，制成纤薄的组织切片，HE染色，厚度4 μm，置入普通显微镜的40×物镜镜头下观察。

2.3 Masson染色组织取材同HE染色。参照之前的方法[3]，制成Masson染色切片。染色后，以胶原纤维为主的肉芽和瘢痕组织示蓝绿色，心肌组织示红色。胶原纤维区域大小用ZEN 2.3 lite软件进行分析，其占左心室的比例用胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)值确定。

2.4 TUNEL染色组织取材同HE染色，按照试剂盒说明，石蜡切片，根据TUNEL染色操作步骤，并滴加DAPI复染，置入避光暗室中5 min，PBST清洗3次×1 min，封片。置入LSM 800激光共聚焦显微镜的40×物镜镜头下观察，计数染色阳性的细胞数/视野，取5个不重复视野/切片。

2.5 免疫组化(immunohistochemistry, IHC)组织取材同HE染色。参照之前的方法[3]，将组织祛除干扰杂质后结合PKD1(1 ∶500稀释)或HDAC7(1 ∶200)一抗，4 ℃冰箱中放置12 h，重复PBS冲洗3次×3 min，羊抗兔IgG二抗(1 ∶1 000)标记室温15 min，DAB染色3 min。置入普通显微镜的40×物镜镜头下，计数5个不重复视野染色阳性的细胞数的平均值。

2.6 免疫荧光(immunofluorescence, IF)组织取材同HE染色，切片脱蜡后微波处理15 min，PBS冲洗3次×3 min后兔血清封闭切片，加入一抗抗体PKD1(1 ∶50)或HDAC7(1 ∶50)，4 ℃孵育过夜。d 2取出，PBST冲洗3次×3 min，和Cy3标记的荧光二抗共孵育1 h，滴加DAPI复染，封片。LSM 800激光共聚焦显微镜的40×物镜镜头下观察，ZEN 2.3 lite分析软件计算红蓝荧光比值。

2.7 免疫印迹(Western blot, WB)用RIPA裂解缓冲液(添加蛋白酶抑制剂)浸泡冰箱中冻存的左心室心肌组织，制成组织匀浆后，离心分离提取总蛋白，BCA法确定总蛋白量。每份标本取40 μg蛋白行凝胶电泳，转膜、封闭，孵育PKD1(1 ∶500)或HDAC7(1 ∶100)的一抗抗体，PBS冲洗3次×3 min后和羊抗兔二抗(1 ∶1 000)共孵育，持续2 h，Odyssey扫描仪扫描蛋白条带。α-View SA软件计算样本蛋白/GAPDH参照蛋白的值。

3 结果

3.1 SAB对MI大鼠组织形态学的影响由Fig 1可见，相比Sham组大鼠完整的心肌细胞和组织结构，MI组大鼠心肌组织完整性受到严重破坏，以肉芽和瘢痕组织为主，间杂以残存的肥大心肌细胞；SAB治疗组大鼠完整的心肌和细胞较Sham组增多，少见肉芽和瘢痕组织；CID阻断剂组大鼠心肌组织和细胞结构和MI组相似。这表明SAB可改善心梗后受损的心肌组织形态学。

Fig 1 Effect of PKD1 on histomorphology of MI rats (HE×400)

3.2 SAB对MI大鼠心肌纤维化的影响由Fig 2可见，Sham组大鼠心肌成分也有少量胶原纤维，呈网状分布，以红色心肌纤维为主； MI组大鼠蓝色纤维，胶原占比较Sham组升高(P<0.01)；SAB组大鼠心肌组织结构和Sham组接近，以红色心肌组织为主，和MI组相比，胶原占比下降(P<0.01)；CID组大鼠心肌组织结构和MI组接近，主要是肉芽和瘢痕组织，和SAB组相比，胶原占比升高(P<0.01)。这表明SAB可减少心梗后受损心肌组织的胶原占比。

3.3 SAB对MI大鼠心肌细胞凋亡的影响由Fig 3可见，Sham组大鼠心肌组织几乎全部呈蓝色荧光(示正常心肌细胞)；MI组大鼠心肌组织中蓝色和红色荧光(示凋亡细胞)混合呈现，细胞凋亡计数较Sham组增加(P<0.01)；SAB组大鼠心肌组织中主要呈现蓝色荧光，间杂少量红色荧光，细胞凋亡计数较MI组减少(P<0.01)；CID组大鼠心肌组织中蓝色和红色荧光混合呈现，接近于MI组大鼠，细胞凋亡计数较SAB组增多(P<0.01)。这表明SAB可抑制因心梗后心肌组织受损导致的细胞凋亡。

3.4 SAB对MI大鼠心肌组织中PKD1和HDAC7蛋白表达的影响分别应用IHC染色(阳性表达蛋白示棕黄色)、IF染色(阳性表达蛋白示红色荧光)和WB染色(阳性表达蛋白示灰黑色)检测心肌组织中PKD1和HDAC7的蛋白表达。由Fig 4～7可见，三种检测结果呈现一致的趋势，均表明:Sham组大鼠的PKD1基础表达量较高，HDAC7基础表达量很低；与Sham组相比，MI组大鼠PKD1表达明显降低(P<0.01)，而HDAC7表达和Sham组基本一致；与MI组相比，应用了SAB后，PKD1和HDAC7的表达明显升高(P<0.01)，也高于Sham组(P<0.01)；CID组和MI组基本一致，PKD1和HDAC7表达阳性的细胞数量均较SAB组明显减少(P<0.01)。这表明SAB可上调心梗后心肌组织内PKD1和HDAC7的表达。

Fig 2 Effect of SAB on myocardial fibrosis in MI rats n=10)

Fig 3 Effect of SAB on cardiomyocyte apoptosis in MI rats n=10)

Fig 4 Effect of SAB on PKD1 and HDAC7 protein expression in myocardium of MI rats

Fig 5 Effect of SAB on PKD1 protein expression in myocardium of MI rats (IF)

Fig 6 Effect of SAB on HDAC7 protein expression in myocardium of MI rats (IF)

Fig 7 Effect of SAB on PKD1 and HDAC7 protein expression in myocardium of MI rats (WB) n=10)

4 讨论

本研究大鼠组织形态学变化表明，MI组大鼠心肌梗死后缺血坏死的组织由肉芽组织或者瘢痕组织替代，后两种组织的主要成分为胶原纤维，所以MI组大鼠CVF占比较高；并且心肌缺血受损后除了心肌细胞坏死外，还伴发着病理性凋亡，这也解释了本研究MI组出现红色荧光的细胞数明显增多的原因。无论是坏死还是凋亡，心肌细胞的总量最终都会减少，又无法通过新的再生细胞的补充，剩余的功能细胞负荷加重，心肌细胞需要肥大来适应这一病理学进程，这是HE染色图片中出现部分肥大细胞的原因，和文献报道[7]的MI后残存的心肌组织中有30%的心肌细胞出现肥大相一致。心肌细胞坏死、凋亡和病理性肥厚，如果不能采取有效的干预措施，将会出现心功能衰竭的严重后果[5, 8]。SAB给药干预14 d后，大鼠心肌组织恢复较好，肉芽或者瘢痕组织明显减少，CVF占比和凋亡细胞数量急剧下降，但这一药理学作用可以被CID所阻断。这表明，SAB可以保护MI后大鼠缺血损伤的心肌组织，而CID可以抑制SAB的保护作用。

PKD1和HDAC7的蛋白表达分别应用IHC染色、IF染色和WB染色三种不同方法进行检测分析，检测结果保持一致。正常的心肌组织中存在一定量的PKD1表达，但HDAC7的表达量很低。PKD1较高的基础表达量可能与PKD1本身的生物学功能和生理学效应比较广泛，表达位点较多相关[9]，HDAC7的基础表达量过低，可能是其正常情况下处于非活化状态，需要PKD1激活并迁移至细胞核中，才能和其发生生物学偶合后磷酸化激活而发挥生物学效应[9]。MI后受损心肌组织中的PKD1较Sham组减少明显，这也和心梗心肌的功能部分丧失密切相关；HDAC7的表达和Sham组接近，表明损伤并不诱发HDAC7的表达上调。

SAB用药后，PKD1和HDAC7的表达均明显上调，并且伴随着缺血心肌组织受损的明显减轻。之前的研究证实[5]，PKD1用药可以改善MI大鼠心肌组织的血流动力学参数，抑制胶原调控关联蛋白，对抗心肌纤维化，减轻细胞凋亡，并能够对抗缺血心肌组织中的产生的过度炎症反应而保护心肌组织[8]。同时，PKD1是参与促血管新生的重要调控蛋白之一，可以直接上调VEGF的表达，促进毛细血管的新生，增加缺血心肌的微循环血供[6, 9-10]。VEGF反过来也可以通过VEGFR2-PKC信号通路激活PKD1，介导内皮细胞(endothelial cells，ECs)的增殖、迁移和管腔形成[9-10]。PKD1还具有介导内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)[4]和间充质干细胞(mesenchyma stem cell，MSCs)[11]增殖、迁移和管腔形成的作用，而EPCs和MSCs是诱导内源性血管生成的重要的细胞来源。HDAC7是PKD1的底物之一，可被VEGF介导的PKD1信号转导刺激磷酸化激活后，由细胞核向细胞质迁移集聚，促进ECs的迁移、增殖和微血管的出芽新生[9, 12]。结合以上文献报道和本研究结果表明，SAB可能通过调控PKD1/HDAC7轴在促缺血心肌组织血管新生，增加缺血心肌微循环血供，保护受损心肌中发挥着关键的作用。

本研究还发现，应用PKD1的特异性阻断剂CID后，PKD1/HDAC7的表达明显下调。这进一步表明，SAB很可能通过调控PKD1/HDAC7轴而保护缺血受损的心肌组织。