淫羊藿苷通过下调ATF6-DR5信号通路改善异丙肾上腺素所致小鼠左心室心肌细胞凋亡

曾凡群，李晓彤，林小英，李叶丽，杨丹莉

(遵义医科大学药学院，基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

心力衰竭的死亡率居高不下，严重影响患者的生活质量，左心室重构是心力衰竭发生发展的重要病理基础，主要表现为心肌细胞凋亡、心肌细胞肥大和心肌纤维化[1-2]。其中，心肌细胞凋亡是左心室重构的重要机制之一，参与众多心血管疾病的病理过程[3]。此外，细胞凋亡引起心肌细胞的丧失与心力衰竭的发生发展密切相关。因此，减轻心肌细胞凋亡是改善左心室重构、预防心力衰竭的重要策略。

心肌细胞凋亡的机制十分复杂。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是心肌细胞凋亡的重要途径之一[4]。葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)为ERS的标志性蛋白。异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)是诱导心肌细胞凋亡经典模型的工具药之一，用于心脏疾病的研究[5]。研究表明[6]，ISO诱导的心肌细胞凋亡模型中，GRP78与活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)的蛋白水平明显升高、心肌细胞凋亡增多，导致心力衰竭。当细胞受到刺激诱发ERS时，ATF6与GRP78解离后激活死亡受体5(death receptor 5，DR5)表达，促进细胞凋亡[7]。因此，抑制ATF6-DR5信号通路是减轻心肌细胞凋亡的途径之一[7-8]。

淫羊藿苷(icariin, ICA)系小檗科淫羊藿属(Epimediuml.)植物的主要活性成分之一，具有调节免疫系统、抗氧化、改善高血压心脏病等药理作用[9]。但ICA对ISO诱导的心肌细胞凋亡的研究尚未见报道。因此，本研究采用ISO诱导的心肌细胞凋亡模型，观察ICA是否能够改善ISO所致的左心室心肌细胞凋亡，并初步探讨其机制是否与下调ATF6-DR5信号通路有关。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

1.1.1药品 ICA(纯度≥98 %，批号:FY17420615，购于江苏省南京泽朗医药有限公司)；ISO(纯度:>99.0%，货号:HY-B0468，购于MCE公司)。

1.1.2试剂 NON-Fat Powdered Milk(BBI公司，Lot: F704BA0001)；Albumin Bovine V(Solarbio公司，货号:A8020)；GRP78抗体(proteintech公司，货号:11587-1-AP)；ATF6抗体(proteintech公司，货号:24169-1-AP)；DR5抗体(英国Abcam公司，货号:ab8416)；GAPDH抗体(proteintech公司，货号:10494-1-AP)；Anti-Rabbit IgG(BBI公司，货号:D110058-0025)；High-sig ECL Western blot Substrat(Tanon公司，货号:180-501)；Trans-Blot Turbo 5×Transfer Buffer(美国BIO-RAD公司，货号:#10026938)；PVDF膜(millipore公司，货号:IPVH00010)。

1.2 仪器Supply Mini-Protean3电泳仪；Mini Trans-Blot转移系统(美国BIO-RAD公司)；Olympus光学显微镜(日本Olympus公司)；Eppendorf 5417R离心机(德国Eppendorf公司)；ChemiDoc 成像系统(美国BIO-RAD公司)；全波长酶标仪(Thermo公司)；RM2245组织切片机(德国Leica Biosystems公司)。

1.3 实验动物6～7周龄的C57小鼠40只,许可证号:SCXK(湘)2014-0011，♂，40只C57小鼠于SPF级动物房适应性喂养10 d，自由饮水和进食。将其随机均分为4组(n=10):① 正常对照组(Control组)；② ISO组；③ ICA低高剂量组(ICA-L组, ICA-H组)；除Control组外其他3组小鼠经颈背部皮下注射ISO(5 mg·kg-1·d-1)建立心肌细胞凋亡模型[6]，连续14 d。同时，ICA-L、ICA-H组灌胃给予ICA混悬液(15,60 mg·kg-1·d-1)，ISO组给予等量双蒸水，连续14 d。Control组颈背部皮下注射等体积生理盐水(0.01mL·g·d-1)并灌胃等体积双蒸水，连续14 d。

1.4 左心室质量指数的测定末次给药后称量C57小鼠体质量。迅速打开胸腔，取心脏组织，立即置于预冷的PBS溶液中灌洗后用滤纸吸干水分，然后分离左心室(含室间隔)称左心室重量(mg)，计算左心室质量指数(左心室重量/小鼠体重)。

1.5 左心室心肌细胞凋亡的检测随机切取心脏组织并置于4%中性甲醛溶液中固定，包埋，制作石蜡切片，3% H2O2消除内源性过氧化物酶，蛋白激酶K(20 mg·L-1)作用10 min破膜，TUNEL混合液37 ℃孵育1.5 h，converter-POD 37 ℃孵育35 min，以二氨基联苯胺(DAB)显色1～1.5 min、苏木精复染30 s，流水冲洗10 min，用中性树胶封片。使用Olympus显微镜观察心肌细胞的凋亡情况并拍照记录。凋亡心肌细胞核被染成棕色，正常核染成蓝色。使用ImageJ软件计数凋亡细胞数和总细胞数。细胞凋亡率为凋亡细胞数相对于细胞总数的比例。

1.6 左心室GRP78、ATF6和DR5蛋白水平的检测于-80 ℃冰箱迅速取出冰冻心脏组织约50 mg，剪碎后放入500 μL RIPA 裂解液中，加入0.5 μL PMSF溶液，于冰上充分研磨后静置30 min，4 ℃离心20 min(转速:12 000 r·min-1)，用BCA法测上清液的总蛋白浓度。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶行电泳过程，然后采用Bio-Rad Mini Trans-Blot转移系统转膜，7% Non-Fat Powdered Milk 4 ℃封闭3～4 h，一抗结合: GRP78(1 ∶5 000)、ATF6(1 ∶1 500)、DR5(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶10 000)，4 ℃过夜孵育；Anti-rabbit IgG结合(1 ∶5 000)2～3 h，High-sig ECL Western Blot Substrat显色，ChemiDoc成像系统获取图像并采用Image Lab软件进行分析。

1.7 统计学分析按完全随机对照要求收集整理并统计实验数据，数据以±s表示，采用SPSS 18.0软件进行One-way ANOVA处理，方差齐用LSD法，方差不齐用Dunnett’s T3法。

2 结果

2.1 左心室质量指数的改变与Control组相比，ISO组左心室质量指数明显升高(P<0.05)。与ISO组相比，给予ICA后左心室质量指数逐渐降低，以ICA-H组差异最为明显(P<0.05)。见Fig 1。

Fig 1 Effect of ICA on left ventricular mass

2.2 左心室心肌细胞凋亡的变化TUNEL染色结果发现，与Control组相比，ISO组左心室心肌细胞凋亡率是8.94倍(P<0.05)。与ISO组相比，ICA-H组左心室心肌细胞凋亡率降低了31.1%(P<0.05)，见Fig 2。提示ICA能减轻ISO诱导的左心室心肌细胞凋亡。

2.3 左心室GRP78蛋白水平的变化Western blot结果发现，与Control组相比，ISO组左心室GRP78蛋白水平增加了42.7%(P<0.05)。与ISO组相比，ICA-H组左心室GRP78蛋白水平减少了28.7%(P<0.05)，见Fig 3；提示ISO诱导的小鼠左心室心肌细胞凋亡存在ERS，而ICA能抑制ERS的发生。

Fig 2 Effect of ICA on cardiomyocytes apoptosis of left ventricular in C57 mice n=5)

Fig 3 Effect of ICA on GRP78 protein level in left

2.4 左心室ATF6蛋白水平的变化Western blot结果发现，与Control组相比，ISO组左心室ATF6的蛋白水平增加了22.2%(P<0.05)。与ISO组相比，ICA-H组左心室ATF6的蛋白水平减少了22.5%(P<0.05)，见Fig 4。

Fig 4 Effect of ICA on ATF6 protein level in left ventricle of C57 mice n=5)

2.5 左心室DR5蛋白水平的变化Western blot结果发现，与Control组相比，ISO组左心室DR5的蛋白水平增加了17.4%(P<0.05)。与ISO组相比，ICA-H组左心室DR5的蛋白水平减少了24.4%(P<0.05)，见Fig 5。

Fig 5 Effect of ICA on DR5 protein level in left ventricle of C57 n=5)

3 讨论

心肌细胞凋亡的分子机制十分复杂。过度的心肌细胞凋亡促使高血压心脏病患者从代偿性左心肥厚转为失代偿性左心肥厚，导致左心室重构，继而诱发心力衰竭[10]。ISO诱导的心肌细胞凋亡模型是目前公认的制备心肌凋亡模型之一[5]。该模型具有操作简单、周期短等优点。ISO连续刺激后C57小鼠出现明显的心肌细胞凋亡、ERS及炎症浸润[6]。在本研究中，ISO连续刺激14 d后，与Control组相比，ISO组左心室质量指数明显升高。表明ISO导致C57小鼠左心室重构。给予ICA干预后，与ISO组相比，ICA高剂量组(60 mg·kg-1)左心室质量指数明显降低。提示ICA可减轻ISO诱导的左心室重构。Yang等[6]研究表明，ISO诱导C57小鼠左心室心肌细胞凋亡明显增加。本研究TUNEL染色结果显示，与Control组相比，ISO组左心室心肌细胞凋亡率明显增加。与ISO组相比，ICA高剂量组(60 mg·kg-1)左心室心肌细胞凋亡率明显减少；表明ICA具有改善ISO所致左心室心肌细胞凋亡作用。

GRP78属于热休克蛋白质70家族的成员，是内质网分子伴侣蛋白中最具代表性的蛋白之一，主要作用是促进蛋白质正确折叠、组装和转运。非ERS时，GRP78与跨膜传感器结合处于失活状态。ERS发生早期GRP78与跨膜传感器分离，激活未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction, UPR)恢复细胞功能，防止ERS引起的细胞损伤，若ERS持续存在，高表达的GRP78触发细胞凋亡相关信号通路，导致细胞损伤加重甚至细胞凋亡[12]。课题组前期研究表明[11]，淫羊藿次苷Ⅱ通过下调GRP78的表达减轻ERS，改善自发性高血压大鼠左心室功能。本研究Western blot结果显示，ISO组左心室GRP78的蛋白水平明显升高，表明ISO激活ERS参与左心室心肌细胞凋亡的发生发展。ICA高剂量组(60 mg·kg-1)左心室GRP78的蛋白水平明显降低。提示ICA通过抑制ERS可有效改善ISO所致的左心室心肌细胞凋亡。

ATF6是内质网的跨膜传感器之一，与GRP78解离后处于活化状态。研究表明，ATF6通路激活诱导心肌细胞凋亡，导致肥胖的自发性高血压大鼠发生心脏重构[13]。本研究Western blot结果显示，与Control组相比，ISO组左心室ATF6的蛋白水平明显升高。表明内质网下游凋亡蛋白ATF6被激活。与ISO组相比，ICA高剂量组(60 mg·kg-1)左心室ATF6的蛋白水平明显降低。提示ICA通过抑制左心室ATF6的表达减缓ISO所致的左心室心肌细胞凋亡。

DR5是肿瘤坏死因子受体超家族成员之一，因其胞质区含死亡结构域，通过激活死亡受体募集Fas相关死亡结构域的接头器来诱导细胞凋亡[14]。与GRP78解离后的ATF6可直接入核促使CCAAT/增强子结合同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)的表达，过表达的CHOP通过激活DR5受体导致心肌细胞凋亡[15-16]。本研究Western blot结果显示，与Control组相比，ISO组左心室DR5的蛋白水平明显升高，说明在ISO所致的左心室心肌细胞凋亡模型中DR5蛋白被激活。与ISO组相比，ICA高剂量组(60 mg·kg-1)左心室DR5的蛋白水平明显降低。提示ICA可能通过降低DR5的蛋白水平改善ISO所致的左心室心肌细胞凋亡。

综上所述，ICA具有改善ISO所致的左心室心肌细胞凋亡作用，其机制可能与抑制ATF6-DR5信号通路有关。

(致谢:本实验在遵义医科大学基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室完成，感谢黄波等老师提供的帮助！)