血橙花色苷研究进展

胥 萍，林小靖，付红伟

(1.浙江大学自贡创新中心，四川 自贡 643000；2.浙江大学华南工业研究院，广东 广州 510000，3.浙江大学，浙江 杭州 310000)

血橙(Citrussinensis)属芸香科甜橙类, 因果肉具红色血丝或血斑而得名。我国引入的血橙品种有路比(Ruby)、塔罗科(Tarocco)、马耳(Maltaise)、 桑吉耐洛(Sanguinello)、摩洛(Moro)、脐血橙等。其中路比血橙和塔罗科血橙是主要栽培品种，被誉为“血橙之王”，主要分布在四川、广东、广西和湖南等地[1]。

血橙具有较高的营养价值，尤其是丰富的维生素C、花青素、抗坏血酸、黄酮类化合物和羟基肉桂酸等营养物质以及K、Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Ni 等人体必需元素[2]。血橙果肉的红色是花青素与糖结合形成的苷类化合物所致，是柑橘中唯一含有花青素的品种。花色苷含量是血橙果实的重要质量指标，对人体健康有重要意义，具有抗氧化、抗癌、降低胆固醇、降血压、增加骨密度、减肥、降血脂和防止心血管疾病等功效[3-5]。花色苷的积累开始于裂片边缘的囊泡和血橙果实的花端，其浓度与栽培实践、成熟阶段、遗传、季节与气候条件、收获时间和生理因素密切相关。低温会增加血橙中花色苷的积累，而高温会破坏花色苷。采收后的血橙可以在氧化应激条件下刺激花色苷的合成，可提高花色苷的含量[6]。

1 血橙花色苷种类的研究

花色苷是由其配基花青素与糖以糖苷键形式结合而成的一类化合物，其苷元(花青素)是基于黄酮离子结构，使花色苷具有强抗氧化剂和清除自由基的作用。同时，黄酮离子的发色团特性使花青素成为最常见的天然色素。羟基的数量，糖的性质和数量，以及这些取代基的位置决定了花色苷个体之间的差异[7]。Mondello等采用高效液相色谱/紫外-可见光分光光度计法(HPLC/UV-Vis)从血橙汁中共分离出27种花色苷峰，其中矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3(6”-丙二酰)-β-葡萄糖苷为主要成分，但并未对其他峰进行定性研究[8]。Lee采用高效液相色谱-二极管阵列法(HPLC-DAD)从巴德血橙中共检测出了7种花色苷，其中矢车菊素-3(6”-丙二酰)-β-葡萄糖苷和矢车菊素-3-葡萄糖苷含量分别占到了44.8%和33.6%[9]。DUGO等采用微量高效液相色谱-电喷雾-质谱法(Micro-HPLC-ESI/MS)从西西里血橙中共检测出了8种花色苷，其中芍药素- 3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香苷、3’ -甲花翠素-3(6”- 丙二酰)葡萄糖苷首次在血橙中被发现[10]。Winterhalter等采用高速逆流色谱和制备高效液相色谱法从血橙中分离制备花色苷，并采用高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC- ESI-MS/MS)和核磁共振法(NMR)法进行结构分析，除了以上2种主要成分外，还鉴定出了6种其它花色苷，分别为矢车菊素-3,5-二葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-槐糖苷、飞燕草素-3(6”-丙二酰)葡萄糖苷、甲基花青素-3(6” -丙二酰)葡萄糖苷、矢车菊素-3-(6” -二乙二酰)葡萄糖苷，其中矢车菊素-3-(6” -二乙二酰)葡萄糖苷是在血橙中首次被发现[11]。曹少谦等采用高效液相色谱-电喷雾质谱(HPLC- ESI-MS)法首次从血橙花色苷中检测出了矢车菊素-3-葡萄糖苷的加合物4-乙基邻苯二酚[12]。

2 血橙花色苷的提取与纯化

提取花色苷是从植物中测定总花色苷或者单个花色苷的首要步骤，因此提取方法的选择对后续分析花色苷非常重要。在大多数水果和蔬菜中，花色苷位于表皮细胞附近[13]。提取过程通常涉及使用酸性溶剂，酸性溶剂可以使细胞膜变性，同时溶解花色苷。酸性溶剂可以稳定花色苷，但也可能通过破坏花色苷与金属离子或者其他色素的联系来改变组织中花色苷的天然形态，在浓缩过程中也可能产生酰基和糖基的酸水解[14]。含盐酸的溶剂在萃取浓缩过程中会导致花色苷降解[14]。为了尽量减少花色苷的分解，使用较弱的有机酸(如甲酸、乙酸、柠檬酸或酒石酸)或少量(0.5%到3%)的挥发性酸(如三氟乙酸)，在色素浓缩过程中可以去除。在酸存在的情况下进行的程序需要小心操作，以避免酸依赖的花色苷降解[14-15]。同时根据提取方法的不同，降低提取溶剂与植物原料的比例，可以减少浓缩步骤[14]。

用于提取的溶剂体系不是提取花色苷所特有的，在提取过程中还会提取相当多的其他化合物，花色苷的定性和定量分析会因为这些可能干扰测量的化合物如糖类、蛋白质和纤维素等的存在而变得复杂，因此需要纯化含花色苷的粗提物，从而提高花色苷的纯度来扩大其应用范围。在纯化过程中不同的树脂被用于纯化花色苷，包括离子交换树脂、聚酰胺树脂和凝胶等经过纯化后浓度可以提高10～20倍[16]。其中凝胶Sephadex LH-20柱层析可用于粗提物纯化，也可以用于分离单个花青素。Manley和Shubiak在1975年首次将HPLC应用于单个花色苷分离[17]，HPLC方法目前广泛的应用于总花色苷和单个花色苷的分离纯化中[18]。

曹少谦等[9]将血橙去皮，榨汁离心后取上清液，采用柱色谱法对血橙花色苷制备方法进行了优化，探索了12种树脂对血橙花色苷的吸附和解析能力，最终发现NKA-9 大孔树脂的吸附和解析效果最好，且洗脱剂为50%的柠檬酸乙醇溶液(pH值=2.5)。

3 花色苷的稳定性及其提高技术

由于花色苷容易发生反应，很容易降解并形成无色棕色化合物，因此影响花青素稳定性的因素很多，包括温度、pH、氧气、酶、复合物和金属离子的存在、抗坏血酸、二氧化硫、糖及其降解产物等[19]。一般而言，降低花色苷溶液的pH值至2.8可以促进结构向黄烷阳离子的转移，从而增强稳定性；改变pH会影响其性质，如果pH低于3，一些多糖不能很好地保护花色苷，从而引起降解。pH高于3，容易引起聚合物如变性蛋白。花色苷在溶液介质中有4种结构的变换，在一定条件下花色苷的4种结构之间存在着平衡：蓝色的醌式(脱水)碱(A)、红色的黄烊盐正离子(AH+)、无色的假碱(B)和查尔酮(C)。加入其他化合物如酚类化合物，能够适当延长花青素的稳定性；铁等金属离子的加入也是一种增加花青素稳定性的可行方法。在长期冷藏期间花色苷会发生变化，花色苷的合成在收获后继续进行，其在血橙中的浓度在冷藏期间增加[2,20]。血橙花色苷 pH4.0时对热最为敏感。另外，血橙花色苷对热、光都很不稳定。金属离子都表现出对花色苷热降解的保护作用，Al3+对血橙花色苷有明显的增效作用，且随着浓度增加增色作用越强；Cu2+低浓度下，对花色苷热降解有一定保护作用，但是高浓度下有明显的促进花色苷降解的作用。喻最新等[21]发现经过草酸处理可以明显提高在储藏过程中的花色苷含量。

花色苷稳定化常用的方法有：添加大分子物质、小分子辅色、金属离子螯合和微胶囊化等。其中大分子物质常添加的为多糖类(蛋白质、果胶、瓜尔豆胶)、蛋白质(乳蛋白、酵母甘露糖蛋白等)；小分子辅色物质常见的为多酚和黄酮类、肽和氨基酸类、有机酸类；金属离子螯合剂常见的为Fe3+、Fe2+、Mg2+、Cu2+、Al3+等[22]。微胶囊化是一种用天然或合成高分子材料将固体、液体或气体等物质包埋形成微小粒子的技术，使被包埋物质与外界环境隔离，有效保护其原有活性，增加其贮存稳定性的过程，在花色苷稳定技术中比较常用[22]。微胶囊技术的关键点在于微胶囊壁材和制备方法的探究，这决定了微胶囊化包埋的效果以及释放特性，其中常用的壁材为高分子材料，如壳聚糖、海藻酸钠、阿拉伯树胶、麦芽糊精、蛋白质和卵磷脂等[23-24]。微胶囊的制备方法可分为化学法、物理化学法和物理法，常用的为物理法，包括空气悬浮包衣法、喷雾干燥法、挤压法、超分子包合物形成法、空气蒸发沉积法、静电结合法等[25]。其中，喷雾干燥法是乳化液被雾化成微细液滴分散在高温热气流中脱水干燥，微细液滴水分迅速蒸发，从而实现成膜和干燥，采用该法制成的微胶囊颗粒均一、可溶性好、热稳定性高、适用性广，且成本低廉、工艺简单、易于产业化，在微胶囊产品制备中最常用，据报道有80%～90%的微胶囊都是采用喷雾干燥法制备[26]。目前，已有研究者将黑枸杞、石榴、蓝冠果花色苷以及紫苏油、沙棘果油等通过喷雾干燥法制备微胶囊的报道[27-31]。

4 花色苷的生理活性

花色苷具有多种生理活性，如减少氧化，抗应激和预防冠心病，还能抗菌、消炎和抗癌活动，控制肥胖和糖尿病或改善视力等[32-35]。通过摄入花色苷，以人群为基础的调查显示，花色苷与心血管疾病、糖尿病和癌症发病率的降低有关[36]。同时研究显示，不同健康状况的志愿者摄入富含花色苷的水果后，临床和生物医学指标均有所改善[36]。花色苷的生物学效应已经被经典地与它们的抗氧化能力联系起来，尽管在生理水平上涉及的实际机制还有待建立[37]。一些体外研究、动物模型和人体试验的研究表明，植物中的花色苷能够对组织产生活性氧(ROS)介导的损伤起保护作用[38-39]。Kelebek等[40]采用 DPPH·法评价抗氧化活性，发现摩洛血橙抗氧化能力比桑吉耐洛血橙强。Titta等[41]研究发现血橙花色苷可以抑制大鼠体内的脂肪堆积和体重增加。