感应草石油醚部位的GC-MS分析及其体外生物活性研究

廖彭莹 吴家明 曾维锦 李务荣 廖秋丽 王淼兰 罗 彭 潘为高

1.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530200；2.广西壮瑶药重点实验室(壮瑶药协同创新中心)，广西 南宁 530200

酢浆草科植物感应草Biophytumsensitivum(L.)DC.又名羞礼草、罗伞草、降落伞等，主要分布于台湾、广东、海南、广西、贵州、云南等地，具有化痰定喘、消积利水的功效，用于哮喘、小儿疳积、水肿、淋浊等证[1]，壮医记载其可“调谷道、通水道”，主治哢疳(小儿疳积)、笨浮(水肿)等[2]。在印度阿育吠陀医疗体系中，该植物用作补品、兴奋剂、用于治疗胃痛、糖尿病和哮喘等[3]。现代研究表明，感应草有多方面生理活性，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗疲劳等[3]。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC 3.2.1.20)、α-淀粉酶和二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV)均为人体内重要的糖代谢相关酶。α-葡萄糖苷酶位于人体小肠刷状缘膜上皮细胞，能够水解低聚糖释放出葡萄糖，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以延缓肠道内碳水化合物的吸收，有效控制餐后血糖水平，在预防改善糖尿病大血管并发症方面具有重要作用[4-5]。淀粉酶是分解淀粉和多糖的酶，人体内以α-型为主[6]，α-淀粉酶抑制剂通过抑制肠道内唾液和胰淀粉酶的活性，阻碍食物中多糖的水解和消化，减少糖分摄取[7]。DPP-IV可以降解体内胰高血糖素样肽-1和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽，二者在维持血糖稳定方面均发挥重要作用[8-9]，DPP-IV抑制剂通过增强二者活性，刺激胰岛β细胞再生，提高糖耐量及胰岛素敏感性以有效降低血糖[10]。天然植物资源是人们挖掘医药财富的宝库，类型丰富的二次代谢产物蕴藏着许多潜在药用活性成分，研究人员对药用植物提取物进行筛选分离，已经获得大量能够抑制三种糖代谢相关酶的活性组分[11-13]。研究表明，感应草茎的乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶具有良好的体外抑制活性[14]，在动物实验中感应草叶水提取物和整株水提取物、甲醇提取物则均表现出降糖作用[15-17]。

为了系统深入挖掘感应草的药用价值，分析其降糖作用机理，本实验在已有研究基础上，对感应草的低极性组分进行提取分析鉴定，研究其对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和DPP-IV的体外抑制效果，探讨感应草低极性组分的化学组成及对三种糖代谢相关酶的作用效果。

1 材料与方法

1.1 仪器 电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent 8890/5977B)、旋转蒸发器RE-52AA(上海亚荣生化仪器厂)、DHJF-2005型低温恒温搅拌反应浴(武汉亨泰达仪器设备有限公司)、SHZ-D(III)循环水式多用真空泵(河南省予华仪器有限公司)、HWS-26 型电热恒温水浴锅(上海齐欣科学仪器有限公司)、KQ-500DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、酶标仪(美国Dynex Spectra MR)、721紫外可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)、96孔板(美国True line)、微量移液器(德国Eppendoff公司)、Flex Station 3多功能酶标仪工作站(美国Molecular Devices公司)、DPP-IV抑制活性检测试剂盒(美国Cayman Chemical公司)。

1.2 材料 感应草于2019年4月采于广西武鸣，经云南中医药大学李国栋教授鉴定为酢浆草科感应草属植物感应草(Biophytumsensitivum)的全株，干燥。

石油醚、无水硫酸钠、无水碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、二甲基亚砜(DMSO)均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)(Sigma-Aldrich公司)，阿卡波糖(acarbose)(阿拉丁生化科技股份有限公司)，α-淀粉酶(α-amylase)、3,5-二硝基水杨酸(DNS)(上海麦克林生化科技有限公司)，可溶性淀粉(广东光华科技股份有限公司)，超纯水(南京易普易达科技发展有限公司)。

1.3 石油醚提取物的制备 将感应草药材10 Kg粉碎，用200 L石油醚冷浸提取，提取2次，每次72 h，将提取液过滤，减压浓缩，得到石油醚提取物70 g。

1.4 气相色谱-质谱(GC-MS)分析条件

1.4.1 样品处理 称取感应草石油醚提取物10 mg，用5 mL乙醚充分溶解，静置，取上清液，加入适量无水硫酸钠，静置过夜，离心10 min，取上清液用微孔滤膜过滤，进样分析。

称取感应草石油醚提取物约200 mg，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL石油醚-正己烷(1∶1，V∶V)溶剂使之溶解，再加入0.4 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液10 mL，振荡摇匀，40 ℃水浴加热30 min，再加入蒸馏水20 mL，振摇，静置分层，取上层挥干溶剂后，加乙醚溶解、过滤、浓缩，加无水硫酸钠干燥过夜，取上清液用微孔滤膜过滤，进样分析。

1.4.2 气相色谱分析条件 石油醚提取物分析条件：HP-5MS石英毛细管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；载气为高纯氦气；进样量1 μL；分流比为30∶1；程序升温条件：柱温100 ℃，溶剂延迟3 min，以10 ℃/min升温至150 ℃，维持2 min，再以10 ℃/min升温至200 ℃，维持2 min，再以6 ℃/min升温至280 ℃，维持2 min。

石油醚提取物甲酯化产物分析条件：HP-5MS石英毛细管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；载气为高纯氦气；进样量1 μL；分流比为30∶1；程序升温条件：柱温100 ℃，溶剂延迟3 min，以10 ℃/min升温至150 ℃，维持2 min，再以10 ℃/min升温至200 ℃，维持2 min，再以10 ℃/min升温至280 ℃，维持2 min。

1.4.3 质谱分析条件 电离方式EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，接口温度280 ℃，质量范围50～400 amu。

1.5 对三种糖代谢相关酶体外抑制活性评价

1.5.1 α-葡萄糖苷酶体外抑制活性评价[7,14]以pH 6.8浓度为0.1 mol/L的磷酸缓冲液(PBS)作为反应溶液，将样品配成浓度为625、313、156、78、39 μg/mL的溶液。在酶标板上设样品反应孔(A)、样品对照孔(B)、空白反应孔(C)及空白对照孔(D)，每组设3个重复孔。在A、B孔中均加入50 μL样品溶液，在C、D孔中均加入50 μLPBS缓冲液。在A、C孔中均加入50 μLα-葡萄糖苷酶溶液，在B、D孔中均加入50 μLPBS缓冲液，混合均匀后，37 ℃孵育10 min。再向每孔中加入100 μL浓度为10 mg/mL的pNPG溶液，混合均匀后，37 ℃孵育20 min，最后加入100 μL0.2 mol/L Na2CO3终止反应。在405 nm处读取各孔吸光值(OD)。样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率(IP%)计算公式如下：

1.5.2 α-淀粉酶体外抑制活性评价[7]以pH 6.8的0.02 mol/L磷酸缓冲液(含0.006 mol/L NaCl)作为反应溶液，将样品配成浓度为313 μg/mL的溶液。设样品反应管(A)、样品对照管(B)、空白反应管(C)，每管设3个平行。在A、B管中均加入500 μL样品溶液，在C管中加入500 μL缓冲液。在A、C管中均加入500 μL α-淀粉酶溶液，在B管中加入500 μL缓冲液，混合均匀后，37 ℃孵育10 min。再向每管中加入500 μL1%可溶性淀粉溶液，混合均匀后，37 ℃孵育10 min，最后加入1 mLDNS试剂，沸水浴5 min终止反应，冷却至室温，每管均用纯水稀释至10 mL。在540 nm处读取各管吸光值(OD)。样品对α-淀粉酶的抑制率(IP%)计算公式如下：

1.5.3 DPP-IV酶抑制活性评价[11]按照DPP-IV酶抑制活性检测试剂盒说明书开展活性测试，以pH 7.5的50 mM Tris缓冲液为反应溶液，将样品配成浓度为50 μg/mL溶液。在酶标板上设全酶孔(A)、空白孔(B)及样品孔(C)，每组设3个重复孔。在A孔中依次加入100 μL缓冲液，50 μLDPP-IV酶和50 μL H-Gly-Pro-AMC溶液，在B孔中依次加入150 μL缓冲液，50 μL H-Gly-Pro-AMC溶液，在C孔中依次加入50 μL样品溶液、50 μL缓冲液、50 μLDPP-IV酶和50 μL H-Gly-Pro-AMC溶液。加样结束后，37 ℃孵育30 min。在激发光波长350～360 nm，发射光波长450～465 nm处读取荧光值(F)。样品对DPP-IV酶的抑制率(IP%)计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 气相色谱-质谱分析结果 对感应草石油醚提取物及其甲酯化产物的GC-MS总离子流图中的各峰进行质谱扫描，经计算机检索NIST05a、Wiley275标准谱库，采用峰面积归一化法计算出各成分的相对含量，结果见表1和2，从石油醚提取物中鉴定出7个化学成分，占流出峰总面积的37.95%，其中相对含量最高的成分是棕榈酸乙酯(15.57%)和硬脂酸乙酯(6.39%)，化学成分类型主要是脂肪族类(36.55%)、芳香族类(1.40%)。从石油醚提取物甲酯化产物中鉴定出6个化学成分，占流出峰总面积的39.13%，其中相对含量最高的成分是棕榈酸甲酯(14.99%)和二十四酸甲酯(6.87%)，化学成分类型主要是脂肪族类(36.69%)、芳香族类(2.44%)

表1 感应草石油醚提取物的GC-MS分析结果

表2 感应草石油醚提取物甲酯化产物的GC-MS分析结果

2.2 对三种糖代谢相关酶体外抑制活性评价结果 感应草石油醚提取物对三种糖代谢相关酶的体外抑制活性测定结果见表3、4和5，从中可以看出，石油醚提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用较好，在本测定条件下，其抑制效果优于阳性对照阿卡波糖；在625～39 μg/mL质量浓度范围内，石油醚提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用随样品浓度上升而提高，呈剂量依赖性，其IC50值为81 μg/mL，低于阳性对照阿卡波糖的IC50值393 μg/mL。但石油醚提取物对α-淀粉酶和DPP-IV酶的抑制活性较差，在同等质量浓度下，其抑制效果均低于阳性对照。

表3 感应草石油醚提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率

表4 感应草石油醚提取物对α-淀粉酶的抑制率

表5 感应草石油醚提取物对DPP-IV酶的抑制率

3 结论

从感应草石油醚提取物及其甲酯化产物中各检出7个和6个化学成分，这些成分均为首次从该植物中检出，化学成分类型主要是脂肪族类，包括多种脂肪酸及其酯，分别为棕榈酸乙酯、棕榈酸、亚油酸乙酯、硬脂酸乙酯、9,15-十八碳二烯酸、硬脂酸、二十四酸(相对含量均大于5%)，同时均检出芳香族类成分2,5-二叔丁基酚(相对含量均大于1%)。Jirovetz L.等[18]曾对产于印度的感应草所含挥发油组分进行分析，从中鉴定了69个成分，所得成分以芳香族和萜类成分为主，脂肪族类成分占少数。石油醚提取物和挥发油组分均属于低极性组分，但由于提取方法的差异，所得组分的化学组成一般有较大差异，石油醚冷浸提取温度低，所得组分以醇、酸、酯类为主，水蒸气蒸馏法所得挥发油中酮、醛、萜、烷烃、烯烃类低沸点组分较多[19]。另外，同一品种植物的成分及含量会随着季节不同及生长环境变化而波动，因此不同产地和不同采收季节的药材化学组成有差异[20]。感应草低极性组分的化学组成与产地和时间的相关性有待进一步研究。

活性测定结果表明，感应草石油醚提取物对α-葡萄糖苷酶体外抑制活性较好，在本测定条件下，其抑制效果优于阳性对照阿卡波糖。Liu B等报道海草中的油酸、亚油酸、二十碳五烯酸、α-亚麻酸、花生四烯酸和棕榈酸均对α-葡萄糖苷酶有抑制作用[21]。感应草石油醚提取物中检出的成分主要是脂肪族类，其中的脂肪酸类应为抑制α-葡萄糖苷酶的主要成分。

本研究表明，感应草石油醚提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，抑制效果优于阿卡波糖，其中发挥抑制作用的功能成分包括脂肪酸及其酯类，进一步证实了感应草是开发α-葡萄糖苷酶抑制剂的良好天然植物资源。感应草的化学组成仍有待进一步分析，特别是对不同产地不同时间采集的感应草的化学成分和生理活性的差异性关注较少。本课题组将对其展开更深入的分离分析，挖掘其中能够抑制糖代谢相关酶的活性组分和单体，加深对该植物资源的系统研究。