基因芯片技术在动物疫病检测中的应用研究进展

黄潇航，施远妮，符云芳，江和基，黄志坚，殷光文*

(1. 福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)，福建福州350002； 2. 福建省动物药物工程实验室，福建福州350002)

基因芯片技术是1种结合DNA探针，基于分子杂交技术原理，具有高灵敏性、高特异性、高通量等特点的新型快速检验检测技术。目前在动物疫病诊断上的应用已较为成熟，特别是针对重要人兽共患病及对生产具有重大威胁的动物疫病的检测显示出明显的优势。

1 检测技术原理及特点

基因芯片技术的原理为大量合成的DNA探针有序地固定在芯片载体表面成为基因芯片，待检样品经过扩增和标记后，与基因芯片杂交反应，扫描并分析杂交反应的信号，即可得到待检样品的基因信息[1]。基因芯片技术相比于传统的PCR技术、血清学检测技术具有灵敏度高、高通量的特点。此外，基因芯片技术减少了传统检测技术中为同时检测多种病原而增加多种引物带来的非特异性反应的发生概率，对于多种病原混合感染的诊断显示出较大的优势。在重大动物疫病检测中投入使用能够对疫病早期监控提供重要的技术保障，同时也在出入境疾病检验检疫中发挥较好的监测作用。

2 在重要动物疫病检测中的应用

2.1 猪病检测随着外来猪种的大量引入，我国养猪产业中疫病流行情况日益复杂化，以PCR、血清学检测为主导的传统检测技术开始暴露出诸如假阳性，或因灵敏度较低而无法对某些病原潜伏期及早期感染做出快速诊断等弊端，而基因芯片技术可克服这方面的缺陷。在猪病毒病的诊断方面，吴凤笋等[2]建立了猪细小病毒的基因芯片检测技术，检测灵敏度可达34.5 ng/μL，采用浓度为5 μmol/L的探针与PCR产物于47 ℃杂交1 h即可得到清晰的荧光信号。在对病毒的混合感染鉴别诊断方面，马锐等[3]运用基因芯片检测技术在特异性验证中能够较好地与临床上诱发猪腹泻症状的几类病毒进行有效区分。在多类型病原混合感染的检测上，肖国生等[4]针对猪胸膜肺炎放线杆菌、肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌建立的基因芯片检测技术能够有效鉴别诊断混合感染病例，与PCR检测及病原检测阳性率结果重复率达95%以上。该项技术在猪群疾病中的检测应用在一定程度上填补了传统检测技术的空白，能够满足我国猪病流行日趋复杂形势下的多样本、高精度、低浓度的检测需求。

2.2 禽病检测禽类病毒性疾病的检测对于保障禽类养殖的正常生产具有重要意义，特别是在禽白血病、马立克氏病、传染性法氏囊病等对生产危害较大的禽病检测中，高特异性、高灵敏度、高精确度的低成本、快速早期诊断技术在家禽和水禽生产群体病原净化方面的源头把控发挥着重要作用。基因芯片技术目前主要应用在马立克氏病病毒、禽白血病病毒、传染性法氏囊病病毒等病原的快速检测，在实验室检测和基层实践验证中具有较好的效果。朱瑞豪[5]通过建立检测多种鸡免疫抑制性病毒的基因芯片技术，能够对超低拷贝数(copies)病原进行有效检测。廖秀云等[6]针对禽流感病毒、新城疫病毒和鸡产蛋下降综合征病毒等病原建立的基因芯片检测方法对病原核酸浓度的最低检出限为 4.83 pg/μL，灵敏度较高，与病毒分离鉴定结果高度吻合。对于近年来新发和关注的坦布苏病毒等水禽病毒，国内已陆续建立了相应的液相芯片技术应用于禽类病毒株的混合感染检测，效果较为理想。王樱历等[7]建立的2种水禽病毒液相芯片检测技术，变异系数分别为1.44%、3.94%，可重复性更强。

2.3 草食动物疫病检测在草食动物疫病检测领域，基因芯片技术主要应用在牛、羊、马等草食家畜的烈性传染病防控中，其中围绕人兽共患病病原，如口蹄疫、布氏杆菌、结核杆菌等存在公共卫生潜在风险的病原，基因芯片技术发挥着疫病跟踪监测的重要作用。李铁锋等[8]通过对布氏杆菌特定菌株的抗原构建了适用于布氏杆菌的膜基因芯片技术，特异性较强，适合于基层检测。在病毒检测方面，陈圣军等[9]成功建立了同时检测牛传染性鼻气管炎和赤羽病2种牛群传染病的基因芯片检测方法，体现出较好的特异性，且反应灵敏度高。在马疫病诊断方面，基因芯片技术的使用为马流行性疫病的早期防控提供了更好的监测途径。汪琳等[10]建立了同步检测包括非洲马瘟、西尼罗热病毒等在内的多种病毒的基因芯片检测方法，将检验检疫时间由7～14 d 短到7 h内完成。目前国内现有针对草食动物病毒的基因芯片检测技术可以同时检测分别来自不同草食家畜的5种病毒。徐超等[11]建立的多种草食动物毛皮携带的部分病毒样品最小检测浓度可以低到20 拷贝，且与用于试验对比研究的4种猪禽、病毒无交叉反应。对于一些遗传性疾病的监测，基因芯片技术也具备进一步开发的潜力。在牛的白细胞黏附缺陷病遗传检测中，使用基因芯片技术能够筛选出携带有BLAD基因缺陷的牛，变异系数在5%以内[12]。

2.4 水产动物疫病检测水产动物疫病防控是困扰渔业发展的重要难题，目前基因芯片技术也被国内研究人员尝试应用在鱼类等水产动物疾病的检测中。弧菌病是危害鱼类养殖的一大类重要传染性疾病，某些弧菌感染严重影响鱼类的正常生长发育，造成鱼类群体发病和死亡。朱鹏飞等[13]针对副溶血弧菌等4类弧菌病建立了同步检测的基因芯片技术，在检测性能上相较于普通PCR方法更为灵敏。王胜强等[14]建立了对7种海水养殖鱼类病毒的检测技术，与普通PCR检测结果基本相符，且具备较好的重复性和特异性。在虾蟹等甲壳动物病毒性疾病的检测中，除了基因芯片技术外，其他芯片检测技术也发挥着出色的作用。王政等[15]研发的芯片检测技术可以实现对虾桃拉病毒、黄头病毒、白斑病毒3种病毒的高效检测。在渔业疫病监测方面，基因芯片技术相比于普通PCR检测技术更适合于多种类型病原和混合感染情况的病原鉴别诊断。

2.5 实验动物疫病检测实验动物的身体状况对于实验室动物试验开展和结果的真实性具有不可忽视的影响，因此在专业的权威实验动物生产机构，对实验动物特别是SPF动物采用高效的检测方法进行定期的病原检测对实验动物生产和试验投入意义重大。Wu M等[16]采用芯片技术建立了能够同步检测犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒5种犬类病毒的检测方法，为犬科实验动物的健康生产和环境监测提供了技术保障。尹雪琴等[17]借助基因芯片中的液相芯片技术建立了能够监测实验小鼠痘病毒、腺体病毒、巨细胞病毒、多瘤病毒等4种病毒性疾病的监测方法，具备灵敏度较高、特异性强等特点。Wu M等[18]建立了能够同时检测兔轮状病毒、仙台病毒、兔出血症病毒3种兔病毒的芯片检测方法，能够实现对于浓度为100 copies/μL病毒样品的检测，与PCR阳性检出率相符合。从实验动物疫控和监测方面的研究来看，基因芯片及相关芯片技术能为实验动物的质量监管和环境监测甚至实验动物检疫起到一定的帮助。

2.6 宠物疫病检测冠状病毒是困扰犬、猫健康的重要致病原，目前尽管对于冠状病毒的早期诊断已经有了多种检测技术，但是由于技术方面存在的不足，对冠状病毒等毒株的复杂流行情况的检测依旧存在较大不足。李健等[19]对犬、猫多种冠状病毒建立了芯片检测方法，其性能优于PCR方法。此外，在犬、猫等宠物与人类共患的诸如狂犬病的快速诊断检验检测技术上，基因芯片技术发挥着重要作用。张伟等[20]通过建立的狂犬病病毒基因芯片检测技术与ELISA、RT-PCR进行验证比较，发现同批样品的阳性检出率要远高于2项传统的检测技术，灵敏度较高。此外，在弓形虫等寄生性原虫的检查上，基因芯片对于快速诊断也具有出色的效果。伴随着社会生活水平的提高，犬、猫等宠物作为伴侣动物成为许多家庭中的重要成员，宠物的疾病与保健逐渐成为关注焦点。其中犬瘟热等对宠物犬具有重要致病性的烈性传染病，国内研究人员也尝试将基因芯片技术应用在其早期检测上，为宠物病毒性疾病的早期诊断作出了重要贡献。因此，在宠物疫病监测上基因芯片技术具有广阔的应用前景和进一步的开发价值。

3 小结与展望

基因芯片技术在处理大批量样本方面体现出检测耗时短、特异性强且不容易发生交叉反应等优点。然而该项技术还存在诸多不足，需要不断改进和研究。目前该项技术研发主要集中在细菌、病毒性传染病和遗传性疾病等检测领域，特别是在细菌、病毒检测上应用较多，而在寄生虫研究领域报道较少，目前仅在弓形虫等领域有相关报道。其在未来的寄生虫领域尤其是肠道原虫感染的早期检测方面的进一步研发和推广应用前景值得期待。