宏基因组学在病毒研究上的应用概述

曾茂芹，刘妍罕，张 飘，杨 霞，程振涛，文 明

(贵州大学动物科学学院贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州贵阳550025)

病毒是引起动物传染病的主要病原体之一，具有广泛的宿主及复杂的遗传多样性。病毒在微生物生态系统中处于重要的地位，然而在某些环境中病毒微生物群落的全球多样性研究还处于初级阶段[1]。据估计，目前人们对病毒世界的探知还不及1%[2]。在2018年4月出版的《自然》杂志上报道了1个国际研究团队已经发现了超过200种以前不为人知的病毒，能够导致包括流感和出血热等在内的疾病；在脊椎动物中发现了214种之前从未被描述过的RNA病毒[3]。病毒形态小、基因组变异情况复杂、基因组功能灵活，导致研究难度较大。很多病毒缺乏可分离培养的细胞系，使得60%以上的病毒无法分离获得[4，5]。近年来，新发生的传染病引起了科学家们的广泛关注，主要为新出现的病原体或者经过变异而具有新的生物学特征的已知病原体所引起的传染性疾病，其中大多数是病毒性传染病。传统的病毒发现方法有病毒培养、电镜观察、血清学检测和PCR检测等，在前期研究中发挥了重要作用，但是这些方法自身的缺陷也限制了对新病毒的发现。如：病毒培养只能对少数病毒，而某些病毒缺乏特异的细胞系或者生长过程中观察不到细胞变性(CPE)；电镜观察灵敏度相对较低；血清学检测中高效特异性抗体很难获得，有的会出现交叉反应而影响结果；PCR检测则必须在已知基因序列的基础上进行下一步操作，对于未知的病毒则无能为力[6]。此外，病毒本身也在不断进化以适应宿主环境，增加其核酸多样性，产生新的病毒物种或新的病毒亚型，扩大其宿主范围。开发研究新的病毒检测和发现技术是研究病毒首要解决的问题。

病毒宏基因组学(Viral metagenomics，VM)是1种突破传统方法限制，无需知道病毒核酸序列，而是直接以生物环境中的病毒为研究对象，快速地鉴定出环境中已知和未知的病毒的新兴病毒组学研究技术。通过这种技术可发现很多新病毒，为病毒性疾病的预防和治疗打开新的领域。其克服了传统病毒检测方法所存在的局限性，在监测病毒变异、观察病毒群落、发现新病毒、检测病毒流行情况等方面展现出强大的优势并拥有十分广阔的应用前景，为人类预防和诊断新发、突发病毒性传染病提供了有力的检测技术和方法。

1 宏基因组学的原理和方法

宏基因组学最早可以追溯到1991年，Schmidt T M等[7]首次提出环境基因组学(Environmental Genomics)的概念。传统的宏基因组学分析主要针对细菌和真菌，2002年Breitbart M等[8]第1次将宏基因组学应用于病毒群落研究，应用“鸟枪法”测序研究了海水中的病毒组(Virome)，发现海水中主要病毒组为噬菌体。直到2005年，Edwards R A等[9]首次提出病毒宏基因组学这一概念，描述了噬菌体的系统发育和分类学。总的来说，病毒宏基因组学就是通过一些手段把某些环境中全部病毒同其他微生物区分开来，然后把所获得的病毒组的核酸文库带入现有的数据库进行一致性比对，以达到获得环境中病毒组构成的结果。在此过程中无需知道病毒的核酸序列，而是直接以环境中的病毒组为研究对象，快速、简便地检测出已知和未知的病毒。目前，病毒宏基因组学已经在很多环境样本的研究中得到了广泛应用，包括淡水、土壤、动物的肠道等[10]。病毒宏基因组学通常有2种研究方法。第1种为泛病毒芯片(Pan-Viral Microarrays)，就是将所有已知病毒的代表性序列制成微阵列芯片。虽然泛病毒芯片这种方式可以用来检测几乎所有的已知病毒，但是该技术在筛选宏基因组文库时不能鉴定未知序列的新病毒，且对于环境中丰度低和变异大的病毒检测效果也不理想。第2种为高通量测序(High Throughput Sequencing)，开展病毒宏基因组学研究样品的选择与处理十分重要，而不同样品中的病毒含量差异很大，因此在兼顾环境类型的同时，需选择病毒含量丰富且易处理的样品。从初期感染的组织器官中得到的病毒核酸含量更低，因此需要对病毒进行富集，一般将病毒浓缩到每微升106个粒子以上最为理想。此外，处理时还需要再添加核酸酶降解游离核酸以避免宿主基因组和其他游离基因的干扰。提取的核酸往往采用随机引物法(Sequence Independent Single Primer Amplification，SISPA)进行扩增，扩增后的产物便可高通量测序。研究方法大致有如下几个步骤：样品处理、遗传物质的分离与富集、文库构建、宏基因组学序列的分析和筛选等[11]。

2 宏基因组学在动物病毒研究上的应用

2.1 在水产动物病毒鉴定中的应用近年来，全世界都遇到1个阻碍水产品产业发展的严重问题，即水产养殖中病毒性疾病的发生越来越严重，而且大多数鱼类是人的主要食物来源，鱼类所携带的病毒很有可能传染给人。针对这一问题，世界各国病毒学家都对水产动物病毒的研究给予了高度重视，并获得了大量的研究成果[12]。目前已从养殖和野生水生动物中鉴定出虹彩病毒、呼肠孤病毒、弹状病毒、疱疹病毒和双RNA病毒等不同的病毒[13，14]。随着宏基因组学技术的深入发展，给水产动物病毒的鉴定与发现带来了很多便利。病毒宏基因组学方法直接利用鱼类样本中的病毒基因序列作为研究对象，能够快速、有效地发现各种未知鱼类病毒，而且能直观地显示各种鱼类样本中病毒的种类与丰度。这样就可以方便地了解病毒的分布情况，对某些病原和潜在致病病毒的变化进行实时监测。同时有望诊断由新的或未知病原体引起的鱼类疾病，有利于促进水产养殖业的健康发展，同时也能更好地保障人类健康[15]。

2.2 在陆生动物病毒鉴定中的应用病毒性传染病不仅严重威胁人类的生命安全而且影响经济的发展。近年来流行的病毒性传染病的最大特点就是病原多为动物源性病毒。如：源自于黑猩猩的艾滋病病毒[16]，来自于蝙蝠的埃博拉病毒[17]，来源于中华菊头蝠的“非典”冠状病毒[18]，由绿猴传播的马尔堡病毒[19]，以及现在尚不确定，但初步认为是源自蝙蝠的“新型肺炎冠状病毒”等。呼吸系统疾病(BRD)是对养殖业影响最大的疾病，其影响因素包括环境、遗传和传染等，确定致病病毒比较困难[20]。Cassidy L.Klima等[21]通过病毒宏基因组学方法对BRD病例的呼吸道分泌物中的病毒直接进行表征，再结合病例对照可以提供与复杂传染病相关的候选病原体，将研究的范围有效地缩小，为进一步研究提供参考。病毒性传染病的传播速度快、影响力大、防治难度大。防控病毒性传染病不仅要关注人类本身，还要监测病毒在动物和环境中的动态分布，掌握病毒在中间宿主的携带情况。对此，病毒宏基因组技术将为我们提供更简便的方法、更优质的手段，可以突破传统检测鉴定技术的限制，特别是对未知病毒的及时检测和发现具有重要作用和意义。

3 宏基因组学在人类医学方面的应用

3.1 在临床医学检测中的应用目前在临床医学上仍有很多不明原因的疾病，仅靠常规的实验室检测技术难以做出诊断，这类疾病往往具有很高的发病率和死亡率。例如，据报道我国每年有高达40%，总数约180万的婴儿发生腹泻，但具体病因不明[22]。Svraka S等[22]对不明病因的临床标本进行细胞培养，利用病毒宏基因组技术对1 834份细胞培养上清液进行病原筛查，发现BK多瘤病毒、单纯疱疹病毒及新型Saffold病毒，为临床诊断提供了重要参考。Law J等[23]利用病毒宏基因组学对慢性乙肝、丙肝、自身免疫性肝炎、非酒精脂肪肝等病人的血浆进行研究，结果表明该方法不但快速、可靠，而且检测范围还能扩大到病人的尿液、胆汁、唾液及其他体液。2017年，Yan F等[24]报道了1例因严重的社区获得性肺炎入院治疗的60岁女性患者病例，大量的微生物检测结果均为阴性；对患者的支气管肺泡灌洗液和咽喉拭子标本进行宏基因组测序，结果显示人类鼻病毒B91是含量最丰富的微生物，占全部序列的58.8%，提示感染病原为人类鼻病毒B91，后经病毒稀释血清中和试验得到验证。另有1名有肾移植病史的14岁患者因发热、畏寒、身体疼痛等症状就诊，此后36 h症状加重，甚至出现精神错乱和语言障碍等表现，传统的检测方法均无法确定病因；研究者从该患者的脑脊液中提取RNA进行宏基因组深度测序，成功鉴定出西尼罗病毒，确定为西尼罗病毒感染[25]。此外，许多临床上的肠胃炎、腹泻、呼吸组织感染及肿瘤等疾病的确诊及新病毒的发现都得益于病毒宏基因组学[26，27]。病毒宏基因组学技术突破了传统技术在临床医学病毒检测方面的局限，为病毒核酸检测提供了更加方便快捷的方法，从而促进人类医疗事业的发展。

3.2 在公共卫生领域的应用病毒宏基因组学不同于传统的检测方法，无需知道病毒核酸序列即可快速地检测出病毒，因此可以作为快速监测病毒性传染病的有效手段。例如：2009年H1N1型流感病毒暴发，Greninger A L等[28]使用宏基因组学技术迅速发现并获取了该型流感病毒的全基因组序列。在另一项研究中，Towner J S等[29]利用宏基因组测序，确认了乌干达出血热暴发是由1株新型埃博拉病毒引起。2015年在南美洲、中美洲和加勒比地区暴发的寨卡病毒疫情引起了广泛关注，研究者使用高通量测序从2名孕妇患者的羊水标本中检测出寨卡病毒，最终确定了感染病原。众所周知，在控制传染病方面预防的效率要比治疗高得多，因此对于未知病原的快速检测和预防是1项大工程。如何及时、快速、高效地检测病毒一直是公共卫生领域的关注重点。病毒宏基因组学在未知病毒的检测和鉴定上的成功运用，将会成为检测和预防病毒性传染病的有效手段，从而促进人类公共卫生事业的发展。

4 小结与展望

宏基因组学通过在新病毒发现和医学上的成功运用，有效地证明了其作为1项新兴检测病毒技术的强大作用。它突破了传统检测方法的局限，能快速有效地检测出病毒性疾病和发现新病毒，这一特点将为我们预防和诊断新发、突发病毒性传染病提供有力的检测技术。目前，宏基因组学技术已被发达国家广泛应用于临床标本检测和新病毒的发现；在我国主要应用于感染性疾病的诊治、肠道微生物的研究、动物病毒性疾病的检测等方面[30～32]。宏基因组学也存在一些局限，主要因为在高通量测序技术中，样品的处理需要过滤掉杂质，而每次过滤都会损失一些病毒粒子，从而为后续的分析增加了难度；而且得到的数据是庞大的，这也为后续的生物信息学分析加大了难度。虽然此项技术目前还面临着很多的难点和需要完善的地方，但随着生物技术和医学技术的不断发展和提高，宏基因组学技术将会被广泛应用于病毒方面的研究，从而推动我国生物学和医学事业迈上新的台阶。