1 株灰黄霉素产生菌的诱变选育 及其发酵条件优化

罗秀针 郑金华 林燕燕 张文华

摘 要： 以灰黄霉素产生菌 ji 2 为出发菌株经过紫外线与氯化锂诱变处理，选育出灰黄霉素效价高且发酵周期较短的菌株UL 100 80 ，其效价为 91 304 μg·mL-1 ，比出发菌株 ji 2 提高了47.8%，通过连续传代培养，其遗传稳定性良好。对UL100 80 发酵条件进行优化，优化后液体发酵培养基：大米粉150g·L-1 ，NaCl 8.0g·L-1 ，CaCO 3 8.0g·L-1 ，黄豆饼粉 1.0g·L-1 ，KH 2PO 4 6.0g·L-1 ，KCl 7.0g·L-1 ，NaNO 3 1.0g·L-1 ，FeSO 4 1.0g·L-1 ，pH自然;优化后的培养条件：培养40 h的种子液以12%的接种量接种，28℃下培养12 d，灰黄霉素的效价从未优化前的 91 304 μg·mL-1 提高到 124 965 μg·mL-1 ，提高了36.9%，与出发菌株 ji 2 相比，UL 100 80 产灰黄霉素的效价提高了1.02倍，发酵时间上缩短了48 h。

关键词： 灰黄霉素;诱变育种;效价;培养基;培养条件优化

中图分类号： Q939.9文献标志码： A文章编号： 0253-2301（2020）06-0012-05

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.06.003

Mutation Breeding of a Griseofulin-producing Strain and the Optimization of Its Fermentation Conditions

LUO Xiu-zhen， ZHENG Jin-hua， LIN Yan-yan， ZHANG Wen-hua

（Zhangzhou Health Vocational College， Zhangzhou， Fujian 363000， China）

Abstract：By taking the griseofulin-producing strain ji-2 as the original strain， the strain UL100 80 with high potency of griseofulvin and short fermentation period was selected after the mutagenesis with ultraviolet ray and lithium chloride. The potency of the strain UL100 80 was91 304 μg·mL-1 ，which was47.8 % higher than that of the original strain ji-2， and the genetic stability was good through the continuous subculture. The fermentation conditions of UL100 80 were optimized， and the optimized liquid fermentation medium was as follows： rice flour150 g·L-1 ， NaCl8.0 g·L-1 ，CaCO 3 8.0 g·L-1 ， soybean powder1.0 g·L-1 ， KH 2PO 46.0 g·L-1 ， KCl7.0 g·L-1 ， NaNO 31.0 g·L-1 ，FeSO 4 1.0 g·L-1 ， and pH was natural. The optimized culture conditions were as follows： the seed solution cultured for 40 h was inoculated at 12% dose， and cultured at 28℃ for 12 d. The potency of griseofulvin was increased from91 304 μg·mL-1  before the optimization to124 965 μg·mL-1 ， with an increase of36.9 %. While compared with the original strain ji-2， the potency of griseofulvin produced by UL100 80 increased by1.02  times， and the fermentation time was shortened by 48 h.

Key words：Griseofulvin; Mutation breeding; Potency; Culture medium; Optimization of culture conditions

灰黃霉素由青霉菌 Penicillium griseofulvum 产生[1] ，它属非多烯类抗真菌抗生素，临床上普遍应用于治疗皮肤和角质层真菌感染[2] 。灰黄霉素在农业上有着良好的应用前景[3] ，可防治多种植物病原菌[4-7] 。我国生产灰黄霉素的原料简单，产品成本低，在国际市场上有很强的竞争力，但是灰黄霉素的发酵周期较长，一般为14 d，培养过程易染杂菌，且耗能大，成本高。2008年，张剑青等[8] 对灰黄霉素产生菌——荨麻青霉进行基因组改良，其摇瓶效价为 8 291 μg·mL-1 ，相比原始菌提高了15%，但是改良后的菌株遗传性状不稳定。黄铭杰等[9] 对灰黄霉素产生菌展青霉 FS80 1  进行复合诱变，筛选出高产菌株液体发酵产灰黄霉素效价为 11 982 μg·mL-1 ，比出发菌株提高 37.52%，发酵周期为14 d，发酵周期较长。本试验拟通过诱变育种，选育高产且周期较短的菌株，减少发酵过程中能耗，降低成本，提高效益，这对于工业化生产来说意义非凡。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源 灰黄霉素产生菌 ji 2 由福建师范大学生命科学学院微生物实验室保藏。

1.1.2 主要试剂 无水乙醇、95%乙醇、氢氧化钾、醋酸、对氨基苯磺酸、亚硝酸钠等均为国产分析纯。

1.1.3 主要培养基 斜面培养基：蔗糖30g·L-1 ，KCl 0.5g·L-1 ，NaNO 3 3.0g·L-1 ，MgSO 4 0.5g·L-1 ，FeSO 4 0.01g·L-1 ，KH 2PO 4 1.0g·L-1 ，琼脂20g·L-1 ，pH自然。

种子培养基：大米 50g·L-1 ，NaNO 3 1.0g·L-1 ，NaCl 3.0g·L-1 ，CaCO 3 8.0g·L-1 ，（NH 4） 2SO 4 1.0g·L-1 ，KH 2PO 4 6.0g·L-1 ，KCl 7.0g·L-1 ，FeSO 4 1.0g·L-1 ，pH自然。

液体发酵培养基：大米粉150g·L-1 ，NaCl 8.0g·L-1 ，CaCO 3 8.0g·L-1 ，（NH 4） 2SO 4 1.0g·L-1 ，KH 2PO 4 6.0g·L-1 ，KCl 7.0g·L-1 ，NaNO 3 1.0g·L-1 ，FeSO 4 1.0g·L-1 ，pH自然。

1.2 试验方法

1.2.1 初始培养条件 将菌种接种到斜面培养基，于30℃培养7～8 d后，在试管斜面加入6 mL无菌水制成菌悬液，取2 mL菌悬液接入到装有种子培养基的三角瓶中，30℃下培养35 h后，以15%的接种量将种子液移入到装有发酵培养基的三角锥瓶中，30℃下培养14 d。

1.2.2 灰黄霉素效价测定 绘制灰黄霉素标准曲线[10] 。采用重氮盐法测定[11] 灰黄霉素效价，测定结果以平均值表示。

灰黄霉素效价计算公式：

灰黄霉素效价（μg·mL-1 ）= 由OD430值查得灰黄霉素浓度×稀释倍数

1.2.3 诱变方法 紫外线与氯化锂复合处理：将单孢子菌悬浮液置于紫外线灯（波长为2537，功率30W）下30 cm处照射，并伴以旋转振荡，后涂布于含1%氯化锂的分离培养基平皿上培养，筛选周期较短的高产菌株。

1.2.4 高产突变菌培养条件优化 （1）碳源的选择。以等量的大米粉、燕麦粉、玉米渣、小米粉、小麦粉、麸皮粉分别作为液体发酵培养基中的碳源，研究碳源对菌株

UL 100 80 产灰黄霉素的影响。（2）氮源的选择。分别选择無机氮源3种：（NH 4） 2SO 4、尿素、NaNO 3，有机氮源4种：玉米粉、黄豆饼粉、花生饼粉、蛋白胨为氮源，比较不同氮源对菌株UL 100 80 产灰黄霉素的影响。（3）培养温度的确定。分别将培养温度调整为25℃、28℃、30℃、34℃、37℃，其他条件不变，比较温度对菌株UL 100 80 产灰黄霉素的影响。（4）接种量的确定。分别将种子液按8%、10%、12%、15%、18%种量接种于发酵培养基中，考察接种量对菌株UL 100 80 产灰黄霉素的影响。（5）种龄对菌株UL 100 80 产灰黄霉素的影响。分别将培养25、30、35、40、45、50 h的种子液接种于发酵培养基中，考察种龄对菌株UL 100 80 产灰黄霉素的影响。（6）发酵周期的确定。以上述的优化培养条件培养菌株UL 100 80 ，从第9 d开始定时取样，连续培养15 d，检测其灰黄霉素的效价，以确定其发酵周期。

2 结果与分析

2.1 紫外线与氯化锂复合诱变

以紫外线照射时间为横坐标，致死率为纵坐标，制作复合诱变致死曲线。如图1所示，致死率与紫外的照射时间成正相关，照射时间达180 s，其致死率可达97.5%。

本试验采用紫外线与氯化锂复合对 ji 2 进行处理，紫外线诱变100 s时，致死率为81.4%，筛选出高产菌株UL 100 32 、UL 100 80 、UL 100 46 、UL 100 2 、UL 100 89 ，分别测定突变菌株产灰黄霉素的效价，结果如表1所示，UL 100 80 效价为 91 304 μg·mL-1 ，比 ji 2 提高了47.8%，菌株UL 100 46 的效价仅次于菌株UL100 80，效价比出发菌株提高了32.3%。

2.2 突变株稳定性遗传分析

将筛选的高产菌株UL100 32、UL100 80、UL100 46、UL100 2、UL100 89连续传代，检测效价，以第1代效价为参考，按照相对效价来衡量突变菌株的遗传稳定性，结果如表2所示。遗传稳定性较好的高产菌株有UL100 80、 UL100  32、UL100 2、UL100 89，可作为下一步试验菌株，UL100 46稳定性较差，第2代效价就下降到71.6%，不适合做下一步的试验菌株。

2.3 突变菌株的发芽率

对突变株UL100 80、UL100 32、UL100 2、UL100 89进行孢子培养，观察其18、30 h的生长情况，结果如图2、3所示，菌株UL100 80在18 h其发芽率、一级菌丝率均高于出发菌株 ji 2 ，测定的第10 d效价，菌株UL100 80的效价为 91 304 μg·mL-1 ，比出发菌株ji 2提高了47.8%，可见，UL100 80在较短周期内效价较高，符合目标菌株的特点。

2.4 菌株UL100 80的培养优化

2.4.1 碳源对菌株UL100 80产灰黄霉素的影响 以等量的大米粉、燕麦粉、玉米渣、小米粉、小麦粉、麸皮粉分别作为液体发酵培养基中的碳源，研究碳源对菌株 UL100 80 产灰黄霉素的影响，结果如图4，以大米粉为碳源的效价高于其他碳源，故选择大米粉为碳源进行后续试验。