抗BP5—BSA多克隆抗体的制备及鉴定

王嘉伟+张巫凡+张聪+王臣

摘 要：本研究设计将BP5与BSA偶联制备成免疫原。制定免疫程序，用此免疫原免疫家兔，收集兔抗BP5-BSA血清，并分离纯化动物血清，使之能大批量生产制备。用间接ELISA测定兔抗BP5-BSA多抗血清的抗体效价。用硫酸铵盐析法对多抗血清中的蛋白质进行粗提纯，并检测其含量，为进一步建立BP5-BSA的ELISA检测方法奠定实验基础。

关键词：法氏囊；法氏囊活性五肽；多克隆抗体；ELISA；效价

法氏囊活性五肽 （Bursopentin，BP5） 是从法氏囊中分离所得的一种活性小肽，氨基酸序列为CKDVY（Cys-Lys-Asp-Val-Tyr）。多克隆抗体是采用传统的免疫方法，将抗原物质经不同的途径注入动物体内，经数次免疫后采取动物血液，分离出血清，获得的抗血清。本研究以间接ELISA测定兔抗BP5-BSA多抗血清的抗体效价并分离纯化动物血清，使之能大批量生产制备，多克隆抗体在实验动物生产的主要意义是获得高滴度实验或高亲和力的抗血清，用于实验或诊断测试，为进一步研究法氏囊BP5小肽在体内分布奠定实验基础，并为新型疫苗佐剂的研究开发奠定基础。

一、材料与方法

1.实验材料

2只雄性家兔（约2公斤重）购于洛阳市塔湾村养殖户；将BS5与BSA偶联制备免成疫原，委托上海科肽生物科技有限公司生产。

2.实验动物免疫

将2只家兔分为A对照组、B实验组两组。A组用PBS溶液进行免疫，B组用抗原（BP5-BSA）进行免疫，待家兔适应两天后进行首次免疫，首免14 d后进行二次免疫，二次免疫14 d后进行三次免疫。

3.兔抗BP5-BSA多抗血清采集

首免第7 d，第14 d，二免第7 d，二免第14 d分别对A，B两组的家兔耳缘静脉采血1 mL/只。37℃恒温箱内放置3h后，置于台式离心机中，以4000r/min的速度离心6min，吸取血清于EP管中，做好标记，于-20℃冰箱中保存备用。家兔三免后第7 d，对A、B两组的家兔进行心脏采血，分离出动物血清，保存于-20℃冰箱中备用。

4.兔抗BP5-BSA多抗血清的抗体含量变化

用间接ELISA的方法分别测出兔抗BP5-BSA多抗血清7 d，14 d，21 d，28 d、35 d在450 nm的波长下各孔的吸光度（OD）值。

5.硫酸铵盐析法测兔抗BP5-BSA多抗血清中IgG的含量

取1 mL血清于试管中，加入1 mL生理盐水，混匀，然后于搅拌下逐滴加入2 mL饱和硫酸铵溶液，此时硫酸铵溶液的终饱和度为溶液50%。室温下，放置20 min，3000 r/min离心10 min，弃去上清液，用1 mL的生理盐水将沉淀溶解，再逐滴加入硫酸铵溶液0.5 mL，此时硫酸铵溶液的终饱和度为33%。室温下，放置20 min，重复上述第二步过程1～2 次，末次离心后所得沉淀为蛋白质。在最终沉淀物中加入5 mL生理盐水做5 倍稀释。再从稀释品中取1 mL，加9 mL生理盐水做10 倍稀释，最终所沉淀的蛋白质的稀释度50，分光光度计上读出OD值，用生理盐水调零。

蛋白含量（mg/mL）=（1.45×OD280-0.74×OD260） ×稀釋度

二、结果与分析

1.兔抗BP5-BSA多克隆抗体效价动态变化

采集免疫家兔第7 d，第14 d，第21 d，第28 d，第 35d的血液，经离心后取其血清，用间接ELISA的方法在酶标仪检测其在450 nm的吸光度值。在酶标仪上对酶标板进行检测，所读的OD450值变化如图1所示，家兔BP5-BSA多克隆抗体的量随免疫天数的增多而逐渐增加，首免后的2 周多克隆的含量较少，而二免后的2 周家兔BP5-BSA多克隆抗体的产生速率增加，大约是首免后的二倍。对照组多克隆抗体的量则基本没有变化。实验组与对照组相比较说明，免疫过BP5-BSA的家兔，家兔体内抗体的含量增加，说明BP5-BSA具有良好的免疫原性。

2.硫酸铵盐析法测兔抗BP5-BSA多抗血清中IgG质含量

取硫酸铵盐析法所盐析出的IgG，做50 倍稀释，在紫外分光光度计上，读出OD值计算得：

三、讨论

本次试验通过人工合成BP5-BSA（血蓝蛋白）作为免疫原，并制定免疫程序，经过首免、二免及三免后获得兔抗BP5-BSA多克隆抗体；通过间接ELISA的方法测定兔抗BP5-BSA多克隆抗体的效价，间接ELISA实验结果表明，血清中兔抗BP5-BSA多克隆抗体的量随免疫天数的增加而增多；用硫酸铵盐析对兔抗BP5-BSA多抗血清中的IgG进行提纯，用紫外分光光度计检测血清中兔抗BP5-BSA多克隆抗体含量为5.73 mg/mL。该研究设计为进一步建立BP5-BSA的ELISA检测方法奠定实验基础。

参考文献：

[1] 李德元，陈溥言.法氏囊五肽的分离鉴定及其免疫调节和抗过氧化应激机理的研究[D].2010.2～10.

[2] 王明俊.兽医生物制品学.北京：中国农业出版社，1997.

作者简介：王嘉伟（1994—），男，河南焦作人，本科学历。

王臣（1979—），男，安徽六安人，博士学历，教授，研究方向：动物分子病原学与免疫学。