CAPN3基因突变导致的Calpainopathy的发病机制、临床表现和实验室检测研究进展

张慧卿，路延朋，宋学琴

(河北医科大学第二医院 神经内科，河北 石家庄 050000)

Calpainopathy是由Calpain 3基因(CAPN3)突变导致的calpain3蛋白缺失、减少或功能丧失，临床表现高度异质的遗传性肌病。calpain3蛋白是骨骼肌特有的钙依赖非溶酶体蛋白酶，其缺失减少或功能丧失可导致肩带肌、盆带肌和四肢近端肌肉进行性肌无力和肌萎缩，属于肢带型肌营养不良症(Limbgirdle muscular dystrophy, LGMD)范畴。根据遗传方式LGMD可分为LGMD1型(呈常染色体显性遗传方式)和LGMD2型(呈常染色体隐性遗传方式)，根据累及突变基因类型再分为多种亚型，迄今已发现超过40种基因突变。CAPN3基因突变导致的Calpainopathy 为LGMD2A和LGMD1I, 其遗传方式既有常染色体显性遗传，也有隐性遗传；临床表现轻重不一，轻者仅表现为高肌酸激酶血症，重者严重影响运动能力需坐轮椅；病理改变可为正常、嗜酸粒细胞浸润到肌营养不良样改变等各不相同。本文就Calpainopathy的发病机制、临床表现和实验室检测进行综述。

1 发病机制

Calpainopathy是由CAPN3基因突变所致，其发病机制尚不完全清楚，但目前研究使得我们在基因和蛋白水平有一定的了解。CAPN3基因于1989年被克隆，位于15q15-q21，包含24个外显子，全长40 kb，编码由821个氨基酸组成的相对分子质量为94 k的calpain3蛋白[1]。calpain3蛋白属于calpains家族，Calpains蛋白是细胞内一种钙依赖非溶酶体的中性半胱氨酸蛋白酶。Calpains家族中研究较多的是calpain1和calpain2，又称为μ-calpain和m-calpain，均为异二聚体，由两个亚基组成：一个大亚基(80 kDa)和一个小亚基(28 kDa)[1-2]，这些蛋白广泛存在于身体的各个组织中。Calpain3主要是在肌肉中表达，虽然也可在晶状体、肝脏、大脑和心肌中检测到，但浓度非常低。Calpain3与caplain1、caplain2的大亚基分别有54%和51%的同源序列，三者均具有共同的特性，即钙依赖的酶活性和中性pH中最大酶活性等。Calpain3蛋白可分为4个结构域(Ⅰ-Ⅳ区)，其中Ⅱ和Ⅳ区为具有重要功能的半胱氨酸蛋白酶和钙离子结合区，而且这两区与其他calpain蛋白具有同源序列。Calpain3蛋白的Ⅱ区为保守的钙蛋白酶型半胱氨酸蛋白酶(Calpain-type cysteine Protease conserved, CysPc)结构域，包括两个蛋白酶核心结构域(Protease Core subdomains)PC1和PC2，Ⅱ区与蛋白酶的活性有关。Ⅳ区为PEF(Penta EF hand)结构域，主要为与钙离子结合区域，并帮助calpain3同源二聚化。Ⅲ区为钙蛋白酶型β夹层(Calpain-type Beta-Sandwich, CBSW)功能域，对calpain3激活时所需要的结构改变很重要。除此之外，calpain3还具备3个特有的插入序列：N末端有20～30个氨基酸(N-terminus NS)；位于PC2的插入序列1(insertion sequence 1, IS1)；位于CBSW和PEF之间的插入序列2(insertion sequence2, IS2)，这几个插入序列赋予calpain3蛋白独特的自我催化作用[3-6]。

Calpain3蛋白是骨骼肌细胞内的钙依赖非溶酶体的中性半胱氨酸蛋白酶，其激活需要钙离子释放[7]，需要的钙离子浓度相比calpain1和calpain2要低。Calpain3蛋白作为蛋白酶通过自我溶解而激活，在肌细胞内的肌联蛋白(肌联蛋白在M线和I带具有几个calpain3结合位点)之间发挥作用，其功能包括组装和重塑肌节中的收缩蛋白、调控肌浆网中的钙离子外流、肌膜修复和肌肉再生等[1]。

Calpainopathy的发病机制尚不完全清楚，但推测有几种可能：① Calpain3蛋白是骨骼肌三联管的组成成分之一，其活性下降可导致钙离子的释放异常；②Calpain3蛋白参与组成dysferlin蛋白复合体，在部分LGMD2B(dysferlinopathy)患者中可见继发的calpain3蛋白缺失也证实了这一点，Calpain3蛋白可能会影响肌膜的修复[8]；③CAPN3基因错义突变不仅可以影响calpain3蛋白的酶活性，还可影响蛋白分子之间的结合，从而影响蛋白的完整性；④ Calpain3蛋白在体内结合到肌联蛋白上，肌联蛋白具有调节calpain3蛋白活性和抑制其出现自我降解的作用[1, 9]。CAPN3基因突变(比如R448H或D705G)并没有影响Calpain3的酶活性，但影响了该蛋白与肌联蛋白的结合。和其他大部分肢带型肌营养不良(致病基因编码细胞结构蛋白)不同的是CAPN3基因编码的是一种蛋白水解酶，因此对于任何影响到该酶活性、数量和酶结构完整性的因素都可能致病。

2 临床表现

Calpainopathy可导致肩带肌、盆带肌和四肢近端肌肉进行性肌无力和肌萎缩，属于肢带型肌营养不良症(LGMD)范畴。LGMD为常见的遗传性肌营养不良类型，发病率为4/100 000～7/100 000，LGMD呈常染色体显性遗传者称为1型, 呈常染色体隐性遗传方式者称为2型，再根据突变基因分为多种亚型，迄今已发现超过40种基因突变。CAPN3基因突变导致的Calpainopathy包括LGMD2A和LGMD1I, 前者为常染色体隐性遗传，后者为常染色体显性遗传方式。除遗传方式不同、LGMD1 I症状较轻且少见之外，二者临床表现类似。LGMD2A相对常见，有关它的报道相比LGMD1I较多，一般文献中提及的Calpainopathy多为LGMD2A亚型。2018年欧洲神经肌病中心建议新的LGMD分类和命名，如LGMD2A被称为LGMD R1 calpain3-related[10]。

LGMD2A为常染色体隐性遗传，其发病率有地理区域差异，不同国家报道LGMD2A占LGMD的比率从10%～80%不等，在欧洲为最常见的LGMD类型，但在亚洲特别是我国病例数相对较少见。临床表现与其他LGMD类型相类似，主要为肩带肌、盆带肌和四肢近端肌肉进行性肌无力和肌萎缩，但有临床异质性，临床表现多样且轻重不一，轻者仅表现为高肌酸激酶血症或假性代谢性肌病，重者严重影响运动能力需坐轮椅。常染色体显性遗传者(LGMD1I)的临床表现与LGMD2A相似，但发病年龄可延迟20年左右，无力症状相对较轻。

肢带型肌营养不良2A(LGMD2A)的发病率大约为1/100000。典型的临床表现为选择性、对称性的近端肢体(骨盆带肌、肩胛带肌、躯干肌)无力和萎缩，常有关节挛缩和翼状肩等。患者发病年龄2～55岁，平均18岁左右，初起为步态的异常，上楼困难，举物费力，病情缓慢进展，逐渐出现行走费力，多在发病后20年左右失去行走能力。腓肠肌肥大少见，面肌和颈肌通常不受累，这有助于LGMD2A与面肩肱型肌营养不良的鉴别。可出现关节挛缩，尤其是跟腱挛缩，也可出现髋关节、膝关节和肘关节挛缩，常出现在疾病的早期。心肌受累少见[11]；膈肌受累往往出现在疾病的后期，偶见报道疾病早期即出现呼吸功能衰竭，需要无创呼吸机辅助通气[12]。有几个临床线索提示该病[13]：①早期伸膝、屈髋和大腿内收肌群容易出现无力，肌肉核磁显示大腿内收肌群和股后肌群易受累；②腓肠肌早期出现脂肪浸润；③20%出现翼状肩胛；④50%出现关节挛缩，踝关节、髋关节、膝关节和肘关节易受累；⑤肺功能和心脏常不受累。

该病临床异质性较大，不同患者发病年龄、病情严重程度和疾病进展等存在差异。部分患者缺乏明显的肌无力肌萎缩症状，仅表现为无症状的高肌酸激酶血症(Asymptomatic hyperCKemia)、假性代谢性肌病(Pseudometabolic myopathy)或嗜酸性粒细胞肌炎(Eosinophilic myositis)[14-15]等。

高肌酸激酶血症是指无任何临床症状，仅在查体时发现血清肌酸激酶升高，多为正常参考区间的5～80倍，肌酸激酶水平可有波动起伏。无症状的高肌酸激酶血症也可见于其他遗传性肌病中如dysferlinopathy，因此对于临床上出现无症状的高肌酸激酶血症应给予重视。

假性代谢性肌病通常出现在儿童和年轻患者中，患者可能一直保持无症状阶段很长时间，也可表现为无力、肌痛、运动不耐受或轻微的近端肌无力，实验室检查可见血乳酸增高及肌酶增高。

嗜酸性粒细胞肌炎主要发生在年轻人，伴或不伴肢体无力，肌酶升高，可见外周血嗜酸粒细胞增高，肌肉病理可见嗜酸性粒细胞浸润；嗜酸粒细胞浸润可能是LGMD2A临床前阶段，因此在肌肉活检显示嗜酸性细胞浸润的病人中应该考虑到该病的可能。

该病临床异质性较大，但与基因突变位点和突变类型缺乏明确的相关性，相比错义突变，无义突变似乎更易出现肌无力，临床表型较严重[16-17]。即使相同的基因突变在同一个家系，其临床表型可差异较大；错义突变引起的临床表现难以预测。部分患者在怀孕过程中可病情恶化[18]。

3 肌肉病理

因临床表型不同，病理表现也轻重不一，经基因证实的Calpainopathy患者的肌肉病理可表现为正常的病理、只有个别局灶坏死、明显的肌营养不良样改变或嗜酸性粒细胞浸润的肌源性损害等。

LGMD2A的肌肉组织病理检查中，大多数患者骨骼肌呈肌营养不良样病理改变，即肌纤维肥大、萎缩、不同程度坏死再生伴结缔组织增生。除此之外可见核内移现象、高收缩纤维、旋涡状纤维和分叶纤维。分叶纤维为calpainopathy最显著或典型的病理改变，约见于67%的LGMD2A患者，但分叶纤维还可见于杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)、LGMD2D(又称为α-sarcoglycanopathy)和面肩肱型肌营养不良患者中，但他们的存在与这些疾病的严重程度并不相关；分叶纤维更易在儿科患者中观察到，提示早期的病理变化。Fanin等[19]发现男性肌纤维较女性明显减少；肌纤维的再生在LGMD2A病人的病理中相对于其他类型的LGMD较少出现，比例平均小于3%，分析原因可能为calpain3蛋白的丢失影响了肌纤维的再生过程[20]。

4 蛋白印迹

通过免疫印迹分析肌肉组织中calpain3蛋白减少或缺失是诊断calpainopathy的重要实验室依据，但这种方法会产生假阴性和假阳性结果[21]，需结合基因检测。在20%的LGMD2A患者中，蛋白印迹检查发现caplain3蛋白量表达正常，但其功能丧失或减弱，这会导致假阴性结果。caplain3是一种细胞蛋白酶，它在体外因自溶作用极易降解，且降解速度较快[1]，因此对其检测难度较大；另外其他类型的LGMD中由于相应的蛋白缺失，例如LGMD2B型的dysferlin蛋白[21]、LGMD2J型的肌联蛋白(titin)[22]、LGMD2I型的fukutin相关蛋白等可能会导致caplain3蛋白的继发性减少或缺失，从而导致假阳性结果[7]。免疫印迹分析结果显示的caplain3蛋白数量和该病的严重程度没有关联。

5 基因检测

LGMD2A是第一个明确基因及其分子生物学特征的肢带型肌营养不良，迄今在莱顿肌营养不良数据库(leiden muscular dystrophy database, http://www.dmd.nl/capn3_home.html)中，关于calpainopathy的基因突变已经超过500多种[23]，包括错义突变、无义突变、移码突变、小的缺失、大的缺失等多种突变类型，其中LGMD2A中最常见的突变类型是错义突变(60%左右)且多为复合杂合突变。携带两种无义突变患者常发病年龄早，进展快，有严重的临床表型。携带错义突变患者的临床表型不可预测，可能与突变位点处于蛋白不同重要程度的功能区有关[24]。错义突变中外显子11可能是突变热点；若不论突变类型，外显子21可能是一个突变热点[25]。文献报道的热点突变分布多位于Calpain3的II区和Ⅳ区，这两个区分别为半胱氨酸蛋白酶和钙离子集合区结构域，在钙离子依赖的酶活化过程中起关键作用。导致功能缺失的错义突变如p.Thr184Met and p.Gly222Arg，p.Arg489Gln, p.Arg490Gln and p.Arg490Trp，p.Gly496Arg and p.Ser606Leu等位于蛋白酶功能域II区和Ⅳ区[26]。最近Martinez-Thompson等[27]报道了CAPN3基因突变可能与显性遗传性肌病有关。要注意calpainopathy临床表型具有高度异质性，即使有相同基因突变的同胞兄弟姐妹亦可能有不同的临床表现，所以不能通过基因突变类型和位点判断患者病情严重程度和预后。虽然目前基因检测是诊断遗传性肌病的“金标准”，且检测方法也取得显著的进步，但这不是绝对的，因为某些区域的突变如启动子、内含子和大的缺失等不能被检测到，目前发现有10%的calpainopathy患者基因检测仅发现一个等位基因突变，推测可能存在一些目前技术尚不能检测到的突变。

6 小结

本文针对CAPN3基因突变引起Calpainopathy的发病机制、临床表现与实验室检测进行综述。Calpainopathy的临床表现异质性大，发病机制复杂，尚不完全清楚。目前诊断方法中基因检测费用昂贵，蛋白印迹缺乏一定的敏感性及特异性。但随着研究的深入，相信不久的将来能提高Calpainopathy的诊断率；深入了解其发病机制，精准基因治疗会有更广阔的前景。