甲状腺癌分子诊断的现状与展望

罗定远 欧阳能太

甲状腺癌是内分泌系统发病率最多的恶性肿瘤[1]，我国城市地区女性甲状腺癌发病率位居女性所有恶性肿瘤的第4位，60岁以上人群甲状腺结节发病率为50%～70%[2]，但恶性肿瘤仅占甲状腺结节中的5%～10%。尽管传统诊断方式，如超声、细针穿刺(FNA)等手段能够筛选出大多数甲状腺癌，但是准确性有待提高，如按TBS诊断系统细胞病理还存在较高比例的不确定类型。另外，甲状腺癌的生物学行为在细胞病理层面很难作出具有临床意义的判断。

甲状腺癌分为分化型甲状腺癌(differentiated thyroid cancer，DTC)、甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer，MTC)、低分化甲状腺癌(poorly differentiated thyroid cancer，PDTC)和未分化癌(anaplastic thyroid cancer，ATC)，DTC包括甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer，PTC)和甲状腺滤泡癌(follicular thyroid cancer，FTC)。各种类型的甲状腺癌恶性程度不同，治疗方式和预后也不一样。DTC临床上最常见，约占90%，一般预后较好，但是也有部分DTC早期已出现局部器官侵犯、颈部淋巴结转移或远处器官转移，严重影响病人生存期和术后生活质量[3]。因此，如何精准甄别甲状腺结节的良恶性和评估肿瘤恶性程度具有重要的临床意义。随着甲状腺癌分子机制研究的深入，从甲状腺癌生物学行为的角度，特别是从基因变异层面认识甲状腺癌的本质，分辨低风险甲状腺癌和高风险甲状腺癌已成为可能，这将进一步提升甲状腺癌的精准诊断和治疗。

一、甲状腺癌的基因变异

甲状腺癌发生、发展是多基因调控的结果，转录和转录后调控起主导作用，主要涉及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路及磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT信号等通路激活。其中BRAF、TERT、RAS、RET、PAX8/PPARγ和TP53等基因与甲状腺癌诊断、侵袭性、靶向治疗和预后相关性较为密切。

1.BRAF：BRAF是一种丝氨酸苏氨酸激酶，属于RAF蛋白家族，能激活MAPK通路，与细胞的生长、增殖、凋亡、分化密切相关。BRAF位于7q34，其中15号外显子突变占约89%，11号外显子突变约占11%；2003年首次在甲状腺癌中发现BRAF V600E点突变，此位点突变在甲状腺癌中的发生率最高，引起第600位谷氨酸取代缬氨酸的错义突变，导致MAPK信号通路持续激活。另外，599和601位点突变、BRAF基因易位等变异文献也有报道。PTC中BRAF突变率各研究报道不一，约48%～80%，但在甲状腺良性结节中未发现[4]。在亚洲群人中，BRAF突变频率可能还更高一些[5]。Meta分析显示，BRAF V600E突变的肿瘤不仅明显出现包膜外浸润、淋巴结转移和高临床分期，而且也显示病人的复发率较高和预后相对较差，如BRAF V600E突变的甲状腺癌出现中央区淋巴结转移发生率为46%，故认为其可作为判断中央区淋巴结是否转移的独立预测因子[6]。

2.RAS：RAS基因编码p21蛋白，位于细胞内膜面，具有GTP酶活性，参与细胞增殖信号传导调控系统。RAS热点突变位于2号外显子(密码子12及13)，3号外显子(密码子61)，其中密码子12的点突变最为常见。在机制上，激活的RAS绑定GTP，从而具有GTP激活活性，使GTP转换成GDP，突变RAS失去GTP激活活性，导致RAS组成性激活。突变的RAS能够激活MAPK和PI3K/AKT两条通路，特别是以后者为主，并且RAS主要是在甲状腺滤泡癌的增殖和转移中起主导作用。RAS有3种亚型：HRAS、KRAS和NRAS，在甲状腺癌中突变最多的是NRAS，并主要与滤泡癌复发及预后不良相关[7]。

3.端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)：TERT启动子是酶调节的主要靶点，TERT启动子突变产生一个新的ETS转录因子家族结合位点，上调TERT转录，热点突变位于基因转录起始上游的-124bp(C228T)和-146bp(C250T)，PTC中突变率为5%～15%、FTC为10%～35%、PDTC为20%～50%、ATC为30%～75%。TERT启动子突变与甲状腺癌的恶性程度密切相关，与BRAF突变具有协同作用，增加甲状腺肿瘤的侵袭性[8]。

4.RET：RET属于原癌基因，编码细胞膜受体酪氨酸激酶，RET与PTC基因融合会激活RET，进而激活MAPK和PI3K/AKT通路。目前研究显示相关的基因融合形式有10种以上，其中RET/PTC1 和 RET/PTC3最为常见。DTC中有RET/PTC1和RET/PTC3两种基因融合，约占80%，其中RET/PTC3往往与电离辐射引起的滤泡亚型PTC相关。伴有RET/PTC基因融合的DTC增加EGFR表达和磷酸化，常常出现更多的区域淋巴结转移。此外，50% MTC伴有RET基因点突变，尤其是密码子918位点的突变，约98%的MEN2A病人存在RET基因胚系突变[9-10]。

5.PAX8/PPARγ：PAX8和PPARγ基因的重排发生在2号染色体q13和3号染色体p25之间，导致PAX8和PPARγ基因融合，PAX8/PPARγ融合能够使野生型PPARγ抑制因子的作用失活，同时也能使某些PAX8应答基因激活。这种基因易位在FTC中发生率约为30%～60%，FVPTC约38%。PPARγ基因突变与FTC、非典型甲状腺滤泡腺瘤等有关。在PTC中，PAX8/PPARγ融合仅见于滤泡亚型，且与多灶性及血管侵袭相关[10-11]。

6.TP53：TP53基因含11个外显子和10个内含子，编码p53蛋白，监控细胞周期DNA损伤、调控细胞增殖、维持细胞正常生长和抑制恶性细胞增殖。TP53基因突变多发于5～9号外显子，在各种侵袭型较强的甲乳癌亚型中常见，如甲状腺乳头状癌柱状细胞-高细胞亚型等，而在正常甲状腺组织以及甲状腺滤泡腺瘤、慢性甲状腺炎等良性病变中通常不能检出突变型p53蛋白[4]。因此，目前认为TP53基因与甲状腺癌的发生和去分化有关，提示预后不良。

二、甲状腺癌分子诊断临床应用的现状

明确诊断是肿瘤治疗的前提，超声及超声引导下FNA是甲状腺结节良恶性甄别的首选方法[2，12]。2017 版Bethesda报告系统将细胞学诊断结果分为6个等级[13]，分别为I类-标本无法诊断、Ⅱ类-良性病变、Ⅲ类-意义不明确的细胞不典型病变/滤泡性病变(AUS/FLUS)、Ⅳ类-滤泡性肿瘤/可疑滤泡性肿瘤(FN/SFN)、Ⅴ类-可疑恶性肿瘤和Ⅵ类-恶性肿瘤。其中Ⅲ类恶性风险10%～30%，IV类恶性风险25%～40%。细胞病理诊断的局限性就是存在较大比例的不确定类诊断，对这些良恶性不确定类型进行更进一步的判断显得特别重要。

近年分子检测已广泛应用于临床，目前国际比较知名的甲状腺基因检测产品主要有4个，分别是Afirma，ThyGenX/ThyraMIR，ThyroSeq以及RosettaGX Reveal。Afirma用的是基因芯片，称基因表达分类器(Gene Expression Classifier，GEC)，检测167个基因的mRNA表达水平，其中25个基因用于排除滤髓样癌、转移癌、甲状旁腺组织等，142个基因mRNA用于良恶性判断，敏感性约90%，特异性约52%，阳性预测值(positive predictive value，PPV)约37%，阴性预测值(negative predictive value，NPV)约94%[14]。ThyGenX/ThyraMIR应用两种检测技术，先以二代测序检测5个基因突变和3个基因融合，接着用荧光定量PCR方法检测10个miRNA表达，最后判断良恶性，其敏感性为89%，特异性为85%，PPV为74%，NPV为94%，在特异性、PPV和NPV上均比Afirma GEC高[15]。第3个产品是ThyroSeq，ThyroSeq V3版在V2版的基础上增加到112个基因，不仅检测基因点突变、融合，还增加了拷贝数变异检测，对于以基因拷贝数改变为特征的肿瘤如Hurthle细胞癌诊断和预测提高了检测的特异性和敏感性[7]。RosettaGX Reveal主要检测miRNA，以24个miRNA作为良恶性分类指标，敏感性为85%，特异性为72%，PPV为59%，NPV为91%[16]。虽然在阳性预测值上各个产品的判断标准可能不同，但总体看，以二代测序为基础的检测似乎有更好的应用价值。国内也有多家企业在研发或销售类似产品，相信会有更多的国内临床数据会陆续报道。

三、基因变异与甲状腺癌个体化管理

目前细胞病理学诊断不足以准确评估甲状腺癌的低危/高危状态，分子检测评估甲状腺癌生物学行的研究精尖发展，有望成为甲状腺癌恶性风险分层重要的新指标，为精准的个体化管理提供重要支持。

1.基因变异与积极观察： Ito等[17]观察340例PTMC，随访5年肿瘤直径增大3 mm和颈部淋巴转移的病例分别占6.4%、1.4%，10年占15.9%、3.4%，这说明有一部分PTMC病人可以临床积极观察(active surveillance，AS)，以及等待颈部淋巴结出现转移仍可以手术切除治愈，且无明显并发症；韩国多中心随访370例PTMC，中位随访32.5个月，3.5%出现肿瘤最大直径增加，23.2%出现肿瘤体积增大，在2、3、4、5年体积增加率分别为6.9%、17.3%、28.2%、36.2%，年龄<45岁病人的体积增加率明显多于年龄较大者；其中，随访的过程中，58例(15.7%)病人由于焦虑(37.9%)、肿瘤体积增大(32.8%)和中央区淋巴结转移(8.6%)，实施了手术治疗；研究结果显示，很大一部分PTMC病人积极观察的过程中出现生长的现象，肿瘤体积改变是评估肿瘤生长的敏感方式；积极观察应密切观察中应用，对于年轻的病人来说，尽管不是积极观察的禁忌，但是对于年轻人的应用要慎重[18]；2015ATA指南对于低危PTMC也提出积极观察这一概念，认为积极观察可以作为低危甲状腺癌一种管理方式，但需要更多证据支持[12]。但这些研究仅仅涉及临床观察，并没有探讨BRAF、TERT等变异与甲状腺肿瘤进展变化，同时由于病例选择偏差、人群分布等差异，研究结果需要进一步的证据。

2.基因变异与个体化手术方案制定：外科手术是甲状腺癌治疗的主要方式，而对于部分DTC，是选择腺叶切除还是全切除、是否预防性中央区淋巴结清扫术还存在争议[12]；BRAF V600E 和TERT启动子双突变在原发性和转移性PTC中都有报道，在原发性PTC发生率为7.7%，双突变协同效应预测恶性程度高，与单基因BRAF V600E或TERT突变相比，经过15年随访，双基因突变复发率明显升高、死亡率高。研究发现，RAS和TERT突变也具有协同作用，双基因突变与FTC复发、死亡率升高相关[19]；伴有BRAF/RAS合并TERT启动子突变病人，甲状腺全切除显著减少术后复发风险、淋巴转移和远处转移；2015版ATA指南指出[12]，BRAF突变联合其他基因突变，如TERT、PIK3CA、TP53等基因预示甲状腺癌具有更高的恶性风险，扩大手术范围使病人有更多获益。

3.基因变异与碘治疗：BRAF突变病人出现碘抵抗、放射碘剂量明显高于野生型；BARF突变下调碘代谢相关基因，如NIS、TSHR、SLC26A4、TPO和TG等相关基因，诱导BRAF基因突变能够下调这些基因表达，抑制BRAF突变可以恢复这些基因的表达；BRAF突变上调促癌基因VEGF和MET表达，与肿瘤的侵袭能力和碘治疗失败密切相关[20]；RAS和TERT突变肿瘤病人行甲状腺全切除和同位素治疗使病人有更多获益。在碘难治PTC中，应用MAPK通路抑制剂能恢复甲状腺癌对放射碘的敏感性；最近研究显示，TERT启动子突变也与甲状腺癌吸碘或碘抵抗密切相关；年轻PTC病人对碘治疗敏感、治疗效果好，这通常与BRAF突变率低和TERT启动子突变少见有关[19]。BRAF突变与碘抵抗、淋巴结复发密切相关，BRAF联合TERT启动子双突变推荐行颈部淋巴结的预防性清扫提高治愈率，因为此病例对放射碘不敏感，同位素治疗效果差。在临床实践中，伴BRAF突变的病人并非完全不吸收碘，病人通常对碘治疗部分敏感，增加放射碘剂量和应用BRAF抑制剂通常能增加治疗效果。

4.基因变异与靶向治疗：靶向用药是放射碘治疗抵抗或手术不能切除的甲状腺癌病人具有广阔应用前景的治疗方式。靶向药物主要针对VEGF、MAPK及PI3K等通路。索拉菲尼是一种同时靶向VEGFR、 RET/PTC及 BRAF等的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，2013年FDA就已批准索拉菲尼为治疗局部复发或者转移、放射碘抵抗的进展期DTC。最近一项关于索拉菲尼对 DTC、MTC及 ATC疗效的系统回顾研究表明，部分缓解率和稳定率分别是 21%和60%[21]。凡德他尼属于口服TKI，靶点为VEGFR-1、VEGFR-2和RET，2011年凡德他尼成为第一个被FDA批准治疗症状性或进展性MTC靶向药物。在一个包括331例受试对象的Ⅲ期随机对照临床研究中，凡德他尼治疗组病人的反应率高、降钙素和癌胚蛋白下降，无进展生存期明显延长和病人死亡率降低[22]。卡博替尼是另一种口服TKI，作用 VEGFR-1、 VEGFR-2、 MET 和 RET靶点，2012年也被FDA批准为治疗进展期MTC靶向药物，对于治疗不能切除、局部晚期或转移性MTC效果显著。2018年FDA批准针对NTRK1-3基因融合的靶向药物拉罗替尼(LOXO-101)上市，成为首个被批准的针对特定基因变异，跨肿瘤种类的广谱抗癌靶向药。甲状腺癌中NTRK基因融合的发生率虽然仅约1.5%，但考虑到甲状腺癌庞大的病人基数以及不断增长的发病率，拉罗替尼的问世仍然能为很多晚期甲状腺癌病人带来曙光[23]。总之，靶向药物是难治性或晚期甲状腺癌治疗的新航标。

四、基因变异与遗传性肿瘤

依据细胞来源不同，甲状腺癌分非甲状腺髓样癌(NMTC)和甲状腺髓样癌(MTC)[24]。在NMTC中，家族性非甲状腺髓样癌(FNMTC)占5%～15%，FNMTC指来源于滤泡上皮细胞2代或2代以上直系亲属续贯性罹患甲状腺癌，是一种双侧叶、多灶性疾病，早期出现局部浸润、甲状腺外浸润和淋巴结转移。FNMTC与TCO 19q13.2、PRN1 1q21、NMTC1 2q21位点变异有关，研究发现，这些基因变异可出现在一个或几个家庭中。胚系突变，如ATM、RET、DNA修复基因XRCC128和XRCC329、外源性代谢基因GSTT1和GSTM1与患病风险亦相关。

MTC来源于滤泡旁细胞，家族性或遗传性MTC占20%～25%，它可能作为MEN2综合征的一部分或家族性MTC(FMTC)，其遗传基础为RET基因10q11.2位点突变。MEN2综合征主要分为MEN2A、MEN2B和FMTC。研究发现，FMTC与RET 10q11.2基因突变有关，RET基因长60kb，包含21个外显子。98% MEN2肿瘤突变发生在富含半胱氨酸的胞外结构域，特别是10号外显子(密码子609、 611、 618、 620 和 634)和11号外显子(密码子 630 和 634)。这些突变与95%的MEN2A和85%的FMTC有关。突变位点的不同导致致病表型也不同，包括发病年龄、MTC侵袭性、伴随其他内分泌肿瘤是否发生和发生的时间，这决定手术时间选择、手术方式和手术范围[25]。

五、小结

基于基因变异对甲状腺癌的恶性风险分层和精准个体化管理已得到广泛认可，特别是BRAF V600E和TERT启动子突变对于甲状腺癌的个体化管理显得尤为重要。BRAF V600E或RAS 和TERT 启动子双基因突变强烈预示DTC的高侵袭性和预后不良，对于临床上选择积极观察还是外科处理、腺叶切除还是甲状腺全切除、是否行颈部淋巴结清扫及清扫范围、同位素治疗、靶向治疗等具有重要意义。随着研究的深入，相信将会有更多的基因变异被证明可以用来指导甲状腺癌的个体化管理。