牛轮状病毒VP4基因RT-qPCR检测方法的建立

拜小强，耿金静，白生菊，魏锁成*，李琼毅

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030)

轮状病毒（Bovine rotavirus，BRV）是引起哺乳期犊牛群发病毒性腹泻的主要病原之一，约占犊牛腹泻病例的46%[1]。7日龄内的新生犊牛因消化系统和免疫系统尚未发育完全，而易发感染且病症严重，以食欲废绝、消化道机能紊乱及水样粪便为典型临床症状[2]。该病毒具有株型众多、易发重排、宿主广泛、传播迅速等生物学特性，加之该病致死率最高达50%，尚无高效疫苗和特效药物，使得牛养殖业遭受了巨大的经济损失[3]。另外，已证实RV可在人畜间交叉传播，也对人类公共卫生安全存在潜在威胁[4-7]。

BRV为双链RNA病毒，属呼肠孤病毒科、轮状病毒属成员，病毒粒子呈直径60～80 nm的二十面体立体对称结构，其双链RNA基因组由11个不连续的基因片段组成，共编码6个结构蛋白（VP1～4、VP6、VP7）和6个非结构蛋白（NSP1～6）[8]。其中第4片段编码的VP4黏附蛋白，由776个氨基酸组成，相对分子量约为88 kDa，现已被证实与BRV的毒力、血凝作用及抗原特性存在密切联系[9]。有研究表明，轮状病毒入侵宿主细胞过程中，VP4蛋白被胰蛋白酶水解为VP5和VP8两个多肽[10]。VP5(60 kDa)与病毒吸附及侵入功能相关，进而破坏细胞抑制机制，而VP8（28 kDa）含血凝素抗原和中和抗原，聚集着VP4的主要抗原位点，在疫苗研发过程中发挥着至关重要的作用[11]。因此，经胰酶消化激活的VP4结构蛋白使得BRV的致病性大大增强[12]。轮状病毒株型众多，根据VP4抗原特性，将BRV分为不同的P型（P-serotype）[13]，基于VP4的分型功能和抗原特性，该基因片段可用作BRV的检测靶点，为建立特异的病原检测方法提供了理论支持。目前，实验室检测BRV的方法主要有经典病原检测（电镜和病毒分离）、免疫学检测（ELISA）和基因检测（PCR）三类，荧光定量PCR能快速鉴别诊断病原，具有灵敏度高、特异性强、可实时定量监控等优点，被用于目的基因测试、基因表达分析、病原体检测中[14]。本研究以BRV VP4基因作为检测靶基因设计引物，建立了EvaGreen荧光定量RT-PCR检测方法，为牛轮状病毒的快速检测诊断提供一种经济高效的检测手段。

1 试验材料与方法

1.1 毒株、细胞及病料

牛轮状病毒NCDV株购自中国兽医微生物菌种保藏中心（保存编号：AV51），MA-104细胞接毒培养物-80℃保存；感受态细胞BL-21、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛冠状病毒（Bovine coronavirus，BCV）、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和牛结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis，MB）保存于西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室；1月龄以下犊牛腹泻（持续腹泻3 d以上）粪便样品共47份采集自甘肃兰州市、张掖市和甘南州。

1.2 主要试剂

主要试剂和来源见表1。

1.3 病料样本处理

将采集的犊牛腹泻粪便样品与PBS按1∶10混合，涡旋振荡混匀后25℃、3 000 rpm离心20 min，吸取上清液，按轮状病毒诊断试剂盒(酶联免疫法)说明书步骤进行定性检测，测得的阳性样品保存于-80℃冰箱中。

1.4 引物设计

参考Genbank（Accession：JF693029）发表的BRV VP4核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0设计引物（BRV-VP4-F/BRV-VP4-R），经NCBI Primer-BLAST分析验（见表2），完成设计的引物交由北京擎科生物技术有限公司合成。

1.5 重组质粒标准品制备

取BRV毒液和ELISA检测阳性样本，用病毒RNA提取试剂盒提取RNA，反转录得cDNA作为模板进行PCR，产物经琼脂糖凝胶电泳验证，凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带连接至pMD 18-T克隆载体，用质粒提取试剂盒提取质粒，送北京擎科生物技术有限公司测序。经核酸蛋白检测系统测定的阳性重组质粒保存于-20℃备用。

表1 主要试剂和来源

表2 引物序列信息

1.6 优化反应条件

RT-qPCR反应体系：EvaGreen RT-qPCR Master Mix 25 μl；上下游引物（BRV-VP4-F/R）各1 μl；待测cDNA模板5 μl；DEPC水18 μl；总体积50 μl。对设定的变性、退火、延伸反应条件进行系统优化。pMD 18-T-VP4质粒标准品以10-1～103共5个梯度稀释（copies/μl）后重复3次EvaGreen荧光定量检测，建立横轴为模板起始拷贝数对数值，纵轴为Ct值的标准曲线。

1.7 敏感性检测

对构建的pMD 18-T-VP4质粒标准品进行 10-1、100、101、102和103梯度稀释，用优化后的反应条件进行3次重复检测，对比分析得出最低检测限度。

1.8 特异性试验

用建立的EvaGreen荧光定量检测方法对BRV、BVDV、BCV、CSFV、PEDV和MB进行检测，每个样品做3次重复试验，同时设置空白和阴性对照。

1.9 重复性试验

对pMD 18-T-VP4质粒标准品作5个倍比稀释（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5），进行RT-qPCR检测，记录Ct值，根据建立的标准曲线可得出VP4基因含量（copies/μl）。组内重复试验：将5个梯度稀释的阳性质粒进行RT-qPCR检测，以标准曲线方程计算拷贝数，每个浓度重复测量3次，求组内平均值、标准差和变异系数。组间重复试验：不同质粒含量的标准品进行RT-qPCR 3次独立重复试验，求组间平均值、标准差和变异系数。

2 结果

2.1 BRV VP4基因的扩增

以反转录的cDNA为模板，用VP4基因引物进行扩增，经琼脂糖凝胶电泳验证，结果表明扩增的条带约为890 bp，与测序结果一致（见图1）。

图1 VP4基因扩增条带

2.2 RT-qPCR标准曲线

对建立的RT-qPCR反应条件进行优化，最佳反应条件：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，共40个循环；72 ℃再延伸10 min。以优化后的RT-qPCR检测5个不同浓度（10-1～103）的重组质粒pMD 18-T-VP4，其Ct值分别为29.02、25.35、20.78、17.86和14.73。得出标准曲线（见图2）。

图2 重组质粒标准曲线

标准曲线的斜率为-3.425，截距为30.86，相关系数 R2=0.992，Ct值之间呈良好的线性关系。回归方程为Y=-3.425X+30.86；X为阳性质粒模板拷贝数以10为底的对数值。从而可以得出X与Ct值之间的线性关系曲线方程式为Ct=30.86-3.425X。不同浓度重组质粒的Ct值，从试验结果中直接读取，Ct值代入标准曲线方程可计算出VP4初始拷贝数。

表3 RT-qPCR检测BRV VP4重复性试验结果

2.3 敏感性试验结果

5个梯度稀释（10-1～103）的pMD 18-T-VP4质粒标准品的Ct值分别为29.02、25.35、20.78、17.86和14.73，用标准曲线方程计算出的拷贝数分别为1.72×103、3.25×102、5.76×101、7.21×100和9.36×10-1，表明该方法的最低检出量为7.21 copies/μl。

2.4 特异性试验结果

用建立的RT-qPCR检测BRV、BVDV、BCV、CSFV、PEDV和MB。试验结果显示，仅BRV出现扩增曲线，其他病毒和细菌无任何扩增，阴性对照亦无扩增，即只对BRV的cDNA有良好的扩增，表明建立的方法有良好的特异性（见图3）。

图3 BRV RT-qPCR特异性检测

2.5 重复性试验结果

通过对5个稀释度的pMD 18-T-VP4重复检测，组内CV为0.95 %～1.12 %；组间CV为1.55 %～2.18%（见表3），表明RT-qPCR方法稳定可靠。

2.6 临床样本检测

应用本研究建立的RT-qPCR检测方法检测21份ELISA阳性粪样，结果显示：19份呈阳性，2份为阴性，与ELISA检测的阳性符合率为90.47 %。

3 讨论

轮状病毒在人与动物、不同动物之间有一定的交叉感染，婴幼儿和低龄动物容易通过粪-口途径感染RV，造成小肠绒毛缩短，绒毛上皮细胞凋亡，机能减退为病症的急性胃肠道传染病[14,15]。在牛群中感染A组轮状病毒最为常见[16]，1980年福建畜牧兽医研究所首次在我国发现BRV的存在[17]，随后在各地牛群中陆续分离出不同株型的BRV[18-20]，以G10和G6株型最为普遍[21]。VP4基因编码衣壳黏附蛋白，通常根据VP4确定BRV的基因型。尽管VP4蛋白在病毒蛋白总量的约为1.5 %[22]，但同基因型毒株比对，VP4的核苷酸序列和氨基酸序列高度保守，同源性可达94.6 %～97.8 %[23]，在保证病毒毒力的情况下，可以将该基因作为靶基因进行BRV病原检测。持续感染（PI）动物是主要的传染源，成年牛只隐性感染BRV且持续排毒，能高效、准确地检测隐性持续感染动物成为阻断BRV传播、净化牛养殖场的关键一步。

实时荧光定量PCR根据荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，在畜禽传染病原检测中得到广泛的应用[24-26]。目前以VP4基因作为靶点建立的BRV荧光定量PCR报道较少，本试验应用相对保守的VP4基因作为检测靶点，扩增目的片段后连接载体，重组获得质粒标准品，稀释后绘制标准曲线。建立的RT-qPCR最低检测量为7.21 copies/μl；同步检测5种病毒/菌均无扩增曲线，阴性对照亦无扩增；组内重复和组间重复变异系数分别为0.95%～1.12 %和1.55%～2.18%；应用该方法检测21份ELISA阳性样本，检测符合率为90.47 %。经临床样品检测，证实本方法可行，为牛轮状病毒的初步筛查诊断提供了一种可参考的检测手段。