合作猪DRB基因外显子3遗传变异分析

李越洲，张 勇

（甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070）

高等脊椎动物均存在主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex, MHC）[1,2]的表达，其表达高低对动物的免疫排斥反应有一定的影响，且与动物抗病性关联[3]。MHC作为动物疾病抗性和易感性基因，其相关的研究对辅助选择动物抗病育种具有重要意义[4,5]。猪MHC又称为SLA（Swine Lymphocyte Antigen），位于7号染色体上，分为三个主要类群[6]。SLA基因的多态性与动物免疫反应高度关联，其中第二类群（SLAⅡ）基因的表达参与调控了外源性病原和相关疫苗制剂的免疫应答过程[7]。目前SLAⅡ中4个重要功能基因DRA、DRB、DQA和DQB研究最为广泛。研究表明这些基因在控制机体的免疫应答与免疫调节中起着重要作用[8]，且参与调控猪的抗病性能[7,8]。

合作猪又叫蕨麻猪、山猪或草猪，是甘肃省甘南藏族自治州特有的高原小型原始地方品种，其抗逆性（抗病、抗寒和抗高原等）的研究可为地方猪抗病选育提供重要参考。利用单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）分析个体基因组可更好地解释个体的表型差异[6]。目前有关猪SLA 基因功能研究主要在SLAⅡ 的DRA和DQA基因及DRB 外显子2。合作猪SLA 基因功能的研究报道甚少。解析合作猪SLA基因与个体表型差异和遗传相关性，可为引进地方优质品种和高经济价值国外猪品种提供依据。研究其多态性位点及遗传关联性对猪品种保护以及分子遗传选育具有重要价值。

该研究选用PCR-SSCP和DNA克隆及测序等分子生物学实验技术对合作猪DRB基因的第3外显子序列多态性分析，为深入揭示合作猪的免疫、抗病力的分子理论提供支持，同时为地方优质猪品种遗传育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以合作猪为实验动物。采集甘肃省甘南藏族自治州合作市的合作猪血样286份，每份5 ml抗凝血，-20℃冻存备用。采用苯酚-氯仿抽提法[9,10]提取其基因组DNA，TE溶解，-20℃冻存。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计 参考GenBank数据库合作猪SLADRB基因全序列（登录号：FJ905840.1）设计一对引物（见表1），引物由北京华大生物公司合成，其扩增片段为332 bp。

表1 合作猪DRB基因的外显子3引物相关信息

1.2.2 PCR扩增 以DNA为模板，进行PCR扩增，获得DRB外显子3序列。具体PCR扩增反应过程如下[11]：总体积为 20 µl，其中包含 200 ng/µl 的上下游引物各 0.4 µl，10 mmol/L dNTP 0.5 µl，DNA模板约为50 ng，5 U 的DNA 聚合酶0.2 µl。反应条件如下：预变性 94 ℃ 3 min，变性 94 ℃1 min，退火 57 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 50 s，共计35个循环，最后延伸 72 ℃ 10 min，反应结束后于4 ℃ 保存。PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳，对目的片段进行检测和分析。

1.2.3 扩增产物SSCP检测 取上述PCR产物3 µl加入7 µl的考马斯上样缓冲液中，进行98 ℃变性10 min；冰浴 10 min。经14 %非变性聚丙烯酰胺凝胶（Arc：Bis= 37.5∶1），250 V，4 ℃电泳 35 h，通过银染法显色并照相记录和辨别分型。经SSCP分析和辨型后，利用琼脂糖凝胶进行目的条带的纯化，利用回收试剂盒回收不同基因型个体的PCR产物[12]。

1.2.4 克隆及测序 回收后的目的DNA片段进行pGEM-T Easy载体连接，构建重组质粒，并转化大肠杆菌（Scherichiacoli）DH5α菌株，挑选10个优质菌落培养，菌液经PCR扩增和14%的非变性聚丙烯酰胺凝胶（Arc：Bis= 37.5∶1）电泳（250 V，4℃，35 h），对各个样本和基因型鉴定后送北京华大公司进行测序和鉴定。

1.2.5 数据分析 通过Dnasp 4.0软件分析核苷酸变异位点、氨基酸变异位点以及单倍型[13]；采用Clustal X 软件对核苷酸及氨基酸同源序列进行比对分析[14]；利用MEGA 3.0软件构建系统发育树[15]；SPSS 17.0软件进行Hardy-Weinberg平衡状态统计学分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增合作猪DRB基因第三外显子

合作猪DRB基因第三外显子的PCR扩增产物经1.5 %的琼脂糖凝胶电泳（见图 1），获得了一条清晰且特异性较好条带，其大小约为330 bp，与预期目的片段大小一致。说明该结果可进行下一步的SSCP分析。

图1 合作猪DRB基因第3外显子PCR扩增产物

2.2 合作猪DRB基因第三外显子PCR-SSCP检测

合作猪DRB基因第三外显子的PCR扩增产物经SSCP检测进行辨型（见图2），将不同基因型的个体的PCR产物进行纯化回收后克隆其序列。以菌液和基因组DNA为模板，进行PCR扩增后。其产物进行SSCP比较分析，取上述结果一致的产物进行测序。图2所示为最终确定的测序菌落PCR产物及其SSCP 检测结果。菌液PCR产物经SSCP检测的条带均发现重复，并与基因组DNA的PCR产物经SSCP检测结果中寻得对应的条带。根据上述辨型结果，对菌液进行测序，以确定不同的等位基因。

图2 合作猪DRB基因第3外显子菌液PCR-SSCP检测

2.3 合作猪DRB基因第三外显子克隆和测序

合作猪DRB基因外显子3菌液PCR产物经北京六合华大基因公司测序，结果如图3所示。所得测序结果未出现套峰及杂峰现象，可用于核苷酸序列分析。通过对286头合作猪DRB基因第三外显子进行PCR-SSCP、克隆、测序和序列比较分析，结果发现DRB基因第三外显子存在15个特异性的单倍型序列。

图3 DRB基因第3外显子菌液测序结果

2.4 合作猪DRB基因第三外显子多态位点和等位基因差异分析

286头合作猪共检测到15个等位基因，分别定义为S1～S15，DRB第三外显子的15个单倍型序列进行比对分析，发现与其同源性为98.94%；随后核苷酸序列比对发现了21个变异位点，占分析位点的7.45%；其中16个转换位点，约为变异位点的76.19%，其中G/A的转换位点7个，T/C的转换位点9个。颠换位点5个，约为变异位点的23.81%，其中G/C的颠换3个，A/T的颠换2个。结果表明DRB第3外显子的变异中核苷酸转换变异占比较大。本试验获得的15个单倍型序列与GenBank中猪DRB序列（登录号：FJ905840.1）比对发现其差异较大（见图 4）。

图4 合作猪DRB基因第三外显子等位基因核苷酸比对结果

2.5 等位基因系统发育分析

利用ClustalX软件对合作猪DRB基因外显子3的序列构建进化树（见图 5）。结果显示合作猪DRB基因第3外显子序列系统树未呈现大的分支现象，全为细小分支。结合核苷酸序列比对结果，推断DRB基因可能是由同一等位基因突变分化而来的。

图5 合作猪 DRB基因第三外显子核苷酸序列的NJ进化树

3 讨论

合作猪是我国甘肃省南部甘南地区的主要经济猪品种，是世界上高海拔放牧的猪种之一，具有较强的抗逆性、其肉质鲜嫩[16]、饲料利用率高等多个特点。目前合作猪相关基因的研究主要涉及其生长和发育、抗病性状、繁殖性状等经济性状相关的候选基因。本研究利用PCR-SSCP技术对286头合作猪的DRB基因第3外显子进行多态性分析，发现其多态性极丰富，共发现15个等位基因。经核苷酸序列比对分析，结果显示合作猪DRB基因第3外显子15个等位基因与猪同源性达到98.94%。结果发现21个突变位点且单个等位基因变异位点数量较少，说明DRB基因第3外显子序列相对比较稳定，推断合作猪群体生活环境变化不大。等位基因系统发育分析显示，系统发育树未出现较大分支，全为细小分支，恰好与核苷酸序列比对中单个等位基因突变位点较少相一致。推断合作猪DRB基因最初可能是由同一个等位基因发生细微突变，发育而来的。本研究结果为解析合作猪SLA基因与个体表型差异和遗传相关性提供参考，也为地方优质品种保护和选育提供依据。