固相萃取高效液相色谱法检测速冻黑塌菜中3种合成着色剂

杨 俊, 陈 彬, 程晓宏 , 蒋林惠

南通市食品药品监督检验中心 (南通 226006)

黑塌菜又名塌棵菜，目前在江苏南通及周边地区都有种植，其叶片呈墨绿色，含有大量的膳食纤维、钙、铁、VC、VB1、VB2、胡萝卜素等，经霜冻后肥嫩鲜美而著称。黑塌菜秋季播种、冬春上市，上市时间短，为保证市场需求，黑塌菜开始向商品化生产发展，运用速冻技术保鲜，并制定优质高效生产技术规程和企业标准，企业标准中规定速冻黑塌菜中不得使用合成着色剂[1-6]。

本文根据黑塌菜墨绿色泽，选择柠檬黄、日落黄、亮蓝3种能调和成墨绿色的合成着色剂，采用固相萃取高效液相色谱法测定速冻黑塌菜中的柠檬黄、日落黄、亮蓝含量。该方法无需层析柱的填装，采用DAD时间事件，根据3种合成着色剂出峰顺序，切换不同着色剂的检测波长，提高了方法的灵敏度。本方法操作简便、精密度和准确度良好，满足速冻黑塌菜中3种合成着色剂同时检测的需要。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1260 InfinityII型高效液相色谱仪配二极管阵列(DAD)检测器，美国安捷伦公司；MP-48型正压固相萃取装置，睿科仪器有限公司；Xcelvap型氮吹浓缩仪，美国Horizon公司；VM-2500型多管旋涡混合仪，广东安胜仪器有限公司；TGL-16M型台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；PB-10型pH计，赛多利斯科学仪器有限公司；T25DS25型匀浆机，德国IKA公司。

甲醇(色谱纯)，美国Fisher公司；CNW Poly-sery(SBEQ-CA73-6mL)合成着色剂专用固相萃取小柱，上海安谱实验科技股份有限公司；一水合柠檬酸(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。

标准物质：柠檬黄、日落黄、亮蓝(北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司)，浓度均为1.0 mg/mL。

1.2 方法

1.2.1样品处理

称取5 g样品置于50 mL离心管中，加入10 mL水，10 000 r/min匀浆1 min，10 000 r/min离心5 min，上清液转移到另一个50 mL离心管中，再次用10 mL水提取，合并上清液，用20%柠檬酸溶液调节上清液的pH=3～4，待用。

1.2.2样品净化

将固相萃取小柱放置在正压固相萃取装置上，使用前先采用5 mL甲醇活化，再用5 mL去离子水平衡。将待净化样品溶液全部上样到小柱上，再用10 mL水分两次冲洗离心管，并上样到小柱上。用5 mL甲醇∶甲酸∶水(4∶2∶4，v/v/v)淋洗，10%氨水甲醇6 mL分两次洗脱。洗脱液40 ℃氮吹至近干，加入1 mL流动相复溶，过0.45 μm针式过滤器(PTFE)，上机测定。

1.2.3仪器条件

色谱柱：Poroshell 120 EC -C18(4.6 mm×150 mm×5 μm)；柱温35 ℃；流动相为0.02 mol乙酸铵溶液(A)-甲醇(B)；流速1.0 mL/min；梯度洗脱，0 min95%A、3 min65%A、7～10 min0%A，10.1～21 min95%A；进样量10 μL。二极管阵列检测器时间事件：0～5.2 min检测波长为428 nm；5.2～6.5 min检测波长更改为484 nm；6.5～12 min检测波长更改为628 nm。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

柠檬黄、日落黄、亮蓝为水溶性合成着色剂，在水中有较好地溶解性，实验比较了超声提取、涡旋振荡提取和高速匀浆提取方法，发现黑塌菜经10 000 r/min匀浆处理，能打碎样品组织结构，充分提取样品中3种合成着色剂。由于黑塌菜叶片质地较轻，实验比较了4 000 r/min、6 000 r/min和10 000 r/min转速下的离心效果，采用较高的离心速度10 000 r/min能较好地分离样品和提取溶液，保证样品中的合成着色剂充分地溶解到提取溶剂中。

2.2 天然色素和糖分等杂质的去除

黑塌菜经霜冻后叶片含糖量增加，天然色素也会干扰样品的分析。本文选用合成着色剂专用固相萃取小柱，上样后，比较了甲醇、2%甲酸水、甲醇∶甲酸∶水(4∶2∶4, v/v/v)不同淋洗液淋洗效果，发现甲醇∶甲酸∶水(4∶2∶4, v/v/v)不仅能使天然色素分解褪色，而且能将样品中糖分等杂质除去，且回收率能达到要求。

2.3 检测波长的选择

合成着色剂的高效液相色谱检测波长一般为254 nm，但不同着色剂的最大吸收波长不一样。我们分别提取了柠檬黄(258 nm、428 nm)、日落黄(484 nm)、亮蓝(628 nm)最大吸收波长，比较了加标样品中柠檬黄258 nm和428 nm的提取色谱图，其中柠檬黄在258 nm处色谱图附近干扰峰较多，而在428 nm处色谱图无干扰峰，因而选择428 nm作为柠檬黄检测波长。加标样品中日落黄和亮蓝在其最大吸收波长下的色谱图附近也没有干扰峰，选择484 nm作为日落黄检测波长，628 nm作为亮蓝检测波长。

通过DAD时间事件表，根据3种合成着色剂出峰顺序，切换不同着色剂的检测波长。时间事件：0～5.2 min检测波长为428 nm；5.2～6.5 min检测波长更改为484 nm；6.5～12 min检测波长更改为628 nm。采集加标样品色谱图，优化检测波长下色谱图干扰大幅减少，降低杂质的共流出假阳性风险，同时提高了3种合成着色剂的灵敏度，见图1。

2.4 方法的相关系数和检出限

柠檬黄、日落黄、亮蓝在0.1～20 μg/mL范围内呈良好线性。称取5 g空白样品，在接近检出下限水平进行加标实验，检出浓度均大于3倍基线噪声，计算检出限，见表1。

图1 不同检测波长下色谱图的比较

表1 3种合成着色剂的线性方程和检出限

2.5 方法的精密度和回收率实验

分别称取同一均匀的空白样品5 g，分别加入低、中、高3种不同浓度的各种合成着色剂，浓度分别为0.5、2.0、10.0 mg/kg，每个浓度做6个平行，经提取净化后检测，计算回收率和精密度，见表3。实验表明：3种浓度下速冻黑塌菜中合成着色剂的平均回收率在89.8%～105.9%之间，RSD在0.47%～5.62%之间。

表2 回收率试验和精密度(n=6)

3 结论

本文建立了速冻黑塌菜中3种合成着色剂柠檬黄、日落黄和亮蓝的固相萃取小柱-高效液相色谱测定方法。样品加水经匀浆提取后，转移至活化平衡后的固相萃取小柱，合成着色剂专用固相萃取小柱能选择性地吸附3种合成着色剂，甲醇∶甲酸∶水(4∶2∶4, v/v/v)淋洗能使天然色素褪色，并将样品中糖分等杂质除去，10%氨水甲醇洗脱，氮吹至近干后，1 mL 0.02 mol乙酸铵溶液∶甲醇(95∶5, v/v/v)溶解，0.45 μm针式过滤器(PTFE)过滤后测定，保留时间定性，色谱峰面积定量。该方法无需层析柱的填装，具有操作简便、灵敏度高，精密度和准确度良好，能满足速冻黑塌菜中3种合成着色剂同时检测的需要。